肝细胞癌临床病理组织中IFN-γ、STING和PD-L1的表达及其与预后的相关性

傅 潇,田 涛,高 欢,阮之平,刘梦洁,姜丽丽,王文娟,梁 璇,姚 煜

(西安交通大学第一附属医院肿瘤内科,西安 710061;*通讯作者,E-mail:136690205@qq.com)

免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors,ICIs)程序性细胞死亡蛋白-1(programmed death-1,PD-1)及其配体(programmed cell death ligand 1, PD-L1)单抗的出现为晚期肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者提供了新的治疗方案。IMbrave150的研究结果改写了晚期HCC一线治疗选择,也将ICIs联合抗血管生成治疗写入HCC的指南推荐。然而,目前关于ICIs在HCC中的研究局限于晚期患者,尚无临床证据证实PD-1/PD-L1抑制剂在HCC术后辅助治疗中的作用。

干扰素反应刺激因子cGAMP相互作用因子1(stimulator of interferon response cGAMP interactor 1,STING)通过识别胞质DNA和环二核苷酸分子,诱导Ⅰ型IFN和与先天免疫相关的炎性细胞因子的产生,增强宿主抗肿瘤免疫。在HCC小鼠模型中,STING表达缺失导致自噬和凋亡受抑制,进而促进肿瘤生长,而STING激动剂的加入则逆转了这一现象[1]。鉴于STING通路能够调控先天免疫,并与CD8+T淋巴细胞[2]、树突状细胞[3]、NK细胞[4]、Kupffer细胞[1]等免疫细胞相互作用,研究人员推测STING激动剂联合PD-1抑制剂能够重塑HCC抗肿瘤免疫,抑制HCC发生发展。该设想在PD-1抑制剂耐药的黑色素瘤小鼠模型已得到证实[5]。

IFN-γ通过抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤新生血管形成、促进肿瘤细胞凋亡等作用抑制肿瘤发生发展[6]。IFN-γ介导的抗肿瘤反应被证实与更好预后相关[7]。IFN-γ调控PD-L1表达,IFN-γ相关RNA表达谱与PD-1抑制剂疗效相关[8]。

但是在手术切除的HCC中,IFN-γ、STING、PD-L1与临床病理特征和预后关系的研究有限。本研究纳入了50例接受手术治疗的早中期HCC患者,利用IHC检测PD-L1、STING和IFN-γ在HCC病理组织中的表达,分析PD-L1、STING、IFN-γ与临床病理因素和预后的相关性,以期探索PD-L1、STING和IFN-γ对早中期可切除HCC预后的预测作用。本研究还利用TCGA数据库中接受手术治疗的早中期HCC患者的临床病理资料和RNA测序数据,分析了PD-L1、STING和IFN-γ与临床病理因素和预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取并收集自2011年1月至2013年12月于西安交通大学第一附属医院接受手术切除的50例HCC患者的病理组织标本和临床病理资料。所有患者随访至2021年3月。其中7例患者因临床资料不全或失访被剔除,故一共纳入43例患者。纳入标准:临床诊断或病理确诊为HCC;≥18岁,男女皆可;美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)体力状态评分0～1;接受手术治疗;术前未接受过放化疗;临床和随访资料完整。排除标准:临床资料不全或失访;合并肝外疾病,或其他部位肿瘤;既往或现在同时患有其他恶性肿瘤;术前接受过放化疗。本研究通过西安交通大学第一附属医院伦理委员会审批(批件号:2019伦审科自第155号)。

1.2 IHC检测HCC手术组织中PD-L1、STING和IFN-γ的表达

采用免疫组化SP法,按照试剂盒说明步骤进行操作。结果判定:STING和IFN-γ的表达,随机选取5个高倍视野(×200),按肿瘤阳性细胞比例和着色强度分别进行计分。阳性细胞数:0～5%为0分,5%～25%为1分,25%～50%为2分,50%～75%为3分,75%～100%为4分;染色强度无色为0分,浅黄色为1分,黄色为2分,棕黄褐色为3分。两者得分乘积≥4记为阳性,<4为阴性。PD-L1表达水平判定:随机选取5个高倍视野(×200),根据肿瘤比例评分(tumor proportion score,TPS)进行判定,TPS=PD-L1染色阳性细胞数/总活肿瘤细胞数×100%。

1.3 统计学分析

采用IBM SPSS 23.0进行数据统计学分析。应用studentt检验明确不同分组间PD-L1表达的差异,卡方检验和明确IFN-γ、STING与临床病理因素间相关性。Kaplan-Meier生存曲线分析IFN-γ、STING和PD-L1与预后的关系。Cox比例风险回归模型单因素分析探索临床病理因素、IFN-γ、STING和PD-L1对预后的影响,将单因素分析中P<0.1的因子进行多因素分析,探索影响早中期可切除HCC术后的独立预后因子。以双侧P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IFN-γ、STING和PD-L1在可切除HCC临床病理组织中的表达与临床病理因素的相关性

患者的一般特征见表1。其中32例(74.42%)患者年龄小于60岁;29例(67.44%)患者为男性;39例(90.70%)患者Child-Pugh为A级,其余为B级;41例(95.35%)患者合并乙肝病毒感染;27例(62.79%)患者合并腹水、门静脉癌栓和肿瘤破裂出血;TNM分期中Ⅰ期29例(67.44%),Ⅱ期3例(6.98%),Ⅲ期11例(25.58%);15例(34.88%)患者在初诊时甲胎蛋白(alpha fetoprotein,AFP)高于正常值。

IHC结果显示,14例患者IFN-γ表达阳性,6例患者STING表达阳性(见图1),39例患者PD-L1表达阳性(TPS≥1%),其中11例患者PD-L1高表达(TPS≥50%),4例患者PD-L1表达阴性(TPS<1%,见图1)。

Fisher精确检验分析结果提示,IFN-γ和STING的表达与所有临床病理因素无显著相关性(见表2)。Studentt检验结果提示,PD-L1的表达在不同性别(P=0.01)、是否合并乙肝病毒感染(P<0.001)和初诊时AFP是否高于正常(P=0.02)中表达的差异具有统计学意义(见表3)。

2.2 IFN-γ、STING和PD-L1与早中期可手术HCC患者预后的相关性

Kaplan-Meier生存曲线提示,IFN-γ阳性和阴性组的mDFS分别为10个月和8.2个月,95%CI分别为3.65～16.35个月和5.05～11.37个月,差异不具有统计学意义(P=0.95);IFN-γ阳性和阴性组的mOS均为16个月,95%CI分别为8.81～23.19个月和9.67～22.33个月,差异不具有统计学意义(P=0.43,见图2)。STING阳性和阴性组的mDFS分别为2.50个月和9.80个月,95%CI分别为0～10.90个月和7.48～12.12个月,差异不具有统计学意义(P=0.28);STING阳性和阴性组的mOS分别为12个月和22个月,95%CI分别为4.80～19.20个月和16.22～27.78个月,差异不具有统计学意义(P=0.21,见图3)。PD-L1表达<1%,1%～49%和≥50%组的mDFS分别为10个月、10个月和2个月,95%CI分别为8.30～11.70个月、9.09～10.91个月和1.17～2.38个月,差异具有统计学意义(P=0.004);PD-L1表达<1%,1%～49%和≥50%组的mOS分别为32个月、22个月和10个月,95%CI分别为18.82～45.72个月、17.74～26.26个月和3.53～16.47个月,差异具有统计学意义(P<0.001,见图4)。

Cox比例风险回归模型单因素分析结果提示,PD-L1表达水平、合并症和TNM分期与DFS显著相关(P≤0.01,见表4);PD-L1表达水平、性别、合并症、TNM分期和AF与OS显著相关(P<0.05,见表4)。

图2 Kaplan-Meier生存分析IFN-γ与DFS和OS相关性Figure 2 Association between IFN-γ and disease-free survival, overall survival by Kaplan-Meier survival curve

图3 Kaplan-Meier生存分析STING与DFS和OS相关性Figure 3 Association between STING and disease-free survival, overall survival by Kaplan-Meier survival curve

图4 Kaplan-Meier生存分析PD-L1与DFS和OS相关性Figure 4 Association between PD-L1 and disease-free survival, overall survival by Kaplan-Meier survival curve

将单因素分析中P<0.1的临床病理因素纳入多因素分析后,结果提示,PD-L1表达水平和合并症与DFS显著相关(P<0.05,见表5),PD-L1表达水平与OS显著相关(P<0.001,见表5)。

2.3 TCGA数据库中IFN-γ、STING和PD-L1在HCC临床病理组织中的表达与临床病理特征、预后的相关性

为进一步明确IFN-γ、STING和PD-L1在HCC临床病理组织中的表达与患者预后的相关性,TCGA数据库中231例早中期接受手术的HCC患者的RNA测序数据和临床病理资料被提取用于分析。结果提示:IFN-γ、STING和PD-L1的表达与临床病理因素无显著相关性(见表6)。IFN-γ高表达和低表达组的mOS分别为54.13个月和59.70个月,95%CI分别为25.32～82.95个月和41.67～77.73个月,差异不具有统计学意义(P=0.369);STING高表达和低表达组的mOS分别为54.13个月和未达到,95%CI分别为44.80～63.46个月和未达到,差异不具有统计学意义(P=0.600);PD-L1高表达和低表达组的mOS分别为84.40个月和54.07个月,95%CI分别为34.94～133.86个月和41.95～66.18个月,差异不具有统计学意义(P=0.146,见图5)。

表4 无疾病生存期和总生存期单因素分析

表5 无疾病生存期和总生存期多因素分析

表6 TCGA数据库中IFN-γ、STING和PD-L1的mRNA表达与临床病理因素的相关性

图5 5 TCGA数据库中,PD-L1、STING和IFN-γ与HCC患者OS的相关性Figure 5 Association between PD-L1,STING,IFN-γ and OS in HCC patients from TCGA database

3 讨论

2020年全球新发肝癌病例约为90万,肝癌在男性为第五最常见肿瘤,在女性为第九常见肿瘤,在癌症相关死亡原因中排第四位[9]。HCC占所有原发性肝癌病例的85%～90%[10]。HCC通常是由乙型肝炎、丙型肝炎、酒精或脂肪性肝炎引起的肝炎肝硬化发展而来[11]。手术切除、肝移植和射频或微波消融是早期HCC的标准治疗方案,经动脉化疗栓塞(TACE)和射频消融术是中期HCC患者可选择的治疗方案。然而,由于肝癌发病隐匿,多数患者发病时已到中晚期,失去了手术治疗的指征。自2008年SHARP研究[12]奠定了索拉非尼在晚期HCC一线治疗地位后,其他小分子靶向药物,包括仑伐替尼[13]、瑞格非尼[14]、卡博替尼[15]等药物在一线治疗的疗效均未优于索拉非尼。全球多中心Ⅲ期临床研究IMbrave-150结果提示PD-L1抑制剂阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗与索拉非尼对比,显著延长了晚期HCC患者的无进展生存期(progression-free survival,PFS)和OS[16]。我国的ORIENT-32研究则对比了PD-1抑制剂信迪利单抗联合贝伐珠单抗类似物和索拉非尼一线治疗晚期HCC,结果提示信迪利单抗联合贝伐珠单抗类似物显著改善了中国HCC患者的PFS和OS[17]。此外,PD-1抑制剂纳武利尤单抗和帕博利珠单抗均被批准用于索拉非尼治疗失败的晚期HCC的二线治疗。真实世界研究也提示PD-1抑制剂信迪利单抗联合小分子抗血管生成药物在晚期不可切除HCC中具有良好的疗效和耐受性[18]。目前关于ICIs在HCC围手术期的临床研究还在进行[19,20],ICIs能否应用于早期HCC术后辅助治疗尚无定论,ICIs疗效预测指标也有待进一步探索。

既往研究发现PD-L1表达水平与肿瘤血管浸润相关[21]。与该研究相似,本研究也发现PD-L1的表达与包括门脉癌栓形成、腹水等肿瘤合并症显著相关。在接受ICIs治疗的晚期HCC患者中,Morita等[22]的研究发现,β-catenin表达阴性、PD-L1(CPS≥1%)和高CD8+T淋巴细胞浸润提示更长PFS和OS。虽然目前关于PD-1在手术可切除HCC中的表达与临床病理因素和预后的相关性的研究较少,但是与本研究结果相似,Nie等[23]在73例可手术的HCC病理组织中发现,PD-L1表达与TNM分期显著相关,并且高表达的PD-L1是手术可切除HCC的独立不良预后因素。另一项纳入了387例术后HCC患者的回顾性研究也发现高表达PD-L1与更短OS显著相关[24]。

Qi等[25]通过分析Molecular Signatures Database、Oncomine,、UALCAN、Human Protein Atlas、Kaplan-Meier plotter、LinkedOmics和Tumor Immune Estimation Resource等生物信息学数据库中HCC患者的数据发现,过表达STING与HCC临床分期和病理级别相关,STING mRNA水平表达升高还与更好预后相关。还有研究结果显示,在手术切除的HCC病理组织中,STING的表达与HCC肿瘤大小、AFP水平和CD8+T淋巴细胞浸润程度相关,高表达的STING提示更长的DFS和OS[26]。

基础实验结果提示,IFN-γ促进乳腺癌Trem173/STING在中性粒细胞和单核细胞中的表达,增强抗肿瘤免疫,抑制侵袭转移[27]。更进一步在HCC中发现,IFN-γ作用下,MEF2D被p300乙酰化,并与CD274启动子结合促进转录和PD-L1表达[28]。在临床样本中,血清IFN-γ水平与肿瘤组织和血清PD-L1的表达正相关[29]。

值得注意的是,以上研究均不同程度地纳入了晚期不可手术的HCC患者,而在本研究中我们并未发现IFN-γ和STING与手术可切除HCC患者的预后相关。鉴于本研究纳入的数据有限,我们还在TCGA数据库中探索了PD-L1、STING和IFN-γ与临床病理因素和预后的相关性,但是结果并未发现统计学差异。分析其原因可能有以下两点:一是TCGA数据为RNA测序数据,转录后或翻译后调控可能影响蛋白的表达,mRNA的表达情况不能真正反映蛋白的表达水平。二是对比我院数据和TCGA数据,两者在种族和肝炎病毒感染类型方面存在差异:我院纳入的均为我国患者,几乎所有患者都合并乙肝病毒感染;而TCGA数据库中多为高加索患者,大部分患者不合并肝炎病毒感染,并且合并肝炎病毒以丙肝居多。基于上述临床病理因素的差异,两个队列中HCC患者的肿瘤免疫微环境不同,因此导致PD-L1、STING和IFN-γ与临床病理因素和预后的相关性在两个队列中分析结果不同。

综上所述,本研究证实在我国HCC患者中,PD-L1是手术可切除早中期HCC的独立不良预后因素。