miR-4727-5p通过调控EPS8L3表达抑制乳腺癌细胞的增殖与迁移

黄向华,褚飞虎,金 慧,陈铃丽,毛俊峰

(南通大学附属肿瘤医院,南通市肿瘤医院乳腺外科,南通 226361;*通讯作者,E-mail:huangxh78@163.com)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,在人群中的发病率和死亡率均较高[1]。早期乳腺癌的症状不具有典型性,多数乳腺癌患者首次确诊时已位于中晚期[2]。乳腺癌的耐药率较高,且容易出现早期转移和术后复发[3]。探究乳腺癌的分子诊断标志物和基因治疗靶点是乳腺癌研究领域的重要方向。

微小RNA(miRNA)是一类不具有5'端帽子和3'端多聚腺嘌呤尾的单链小分子RNA,广泛存在于细胞质中,呈现组织和细胞特异性[4]。miRNA多数来源于外显子,表现出较高的保守性,不能翻译成蛋白质[5]。有研究表明,miRNA表达水平与乳腺癌、结肠癌、胆管癌等恶性肿瘤的化疗敏感性、肿瘤体积大小、淋巴结转移显著相关[6]。miRNA表达改变可影响肿瘤患者的生存期,可能成为肿瘤的预后判断标志物和治疗靶点[7]。Liu等[8]研究发现,miR-4727-5p能够显著抑制结直肠癌细胞的增殖和细胞周期进展,增加细胞凋亡率和放疗敏感性,在DNA的损伤修复方面发挥重要作用。miR-4727-5p在乳腺癌组织中的表达及作用机制尚未见报道。本研究旨在检测miR-4727-5p在乳腺癌组织和细胞系中表达水平,探讨miR-4727-5p对乳腺癌细胞增殖与迁移的影响,通过生物信息学和双荧光素酶报告基因实验分析miR-4727-5p与靶基因的靶向关系。

1 材料和方法

1.1 组织标本

选取2019年2月至2021年9月在南通大学附属肿瘤医院(南通市肿瘤医院)乳腺外科手术切除的38例乳腺癌患者的癌组织和癌旁组织,所有组织均经病理学确诊,组织均保存于液氮中。研究方案经本院伦理委员会同意,患者术前均签署知情同意书。

1.2 细胞系和主要试剂

人正常乳腺上皮细胞系MCF-10A、乳腺癌细胞系(MB-MDA-468、SKBR3、MCF-7、T-47D)均购自美国ATCC菌种保藏中心。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒购自美国GeneCopoeia公司。EPS8L3野生型质粒和EPS8L3突变型质粒、重组质粒miR-4727-5p(AUCUGCCAGCUUCCACAGUGG)和空载质粒购自江苏启动子生物科技有限公司。Lipofectamine 3000转染试剂盒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Invitrogen公司。CCK-8试剂盒购自日本同仁公司。RPMI-1640培养基、DMEM培养基购自美国BD公司。蛋白一抗EPS8L3、β-actin、p-EGFR、p-Raf1、p-MEK1抗体和羊抗鼠二抗均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 细胞培养和分组

MCF-7、T-47D、SKBR3细胞用含10%血清的RPMI-1640培养基培养,MCF-10A、MB-MDA-468细胞用含10%血清的DMEM培养基培养。当T-47D细胞融合度为50%时,通过Lipofectamine 3000转染试剂将重组质粒miR-4727-5p和空载质粒转染至T-47D细胞,分组为miR-4727-5p组和对照组(Ctrl组)。转染9 h后更换为含10%血清的RPMI-1640培养基继续培养,转染48 h后进行后续实验。

1.4 qRT-PCR检测乳腺癌组织和细胞系中miR-4727-5p和EPS8L3 mRNA的表达

通过Trizol试剂裂解组织和细胞，微量核酸仪分析总RNA的浓度和纯度，逆转录合成cDNA。以cDNA为模版进行qRT-PCR扩增检测。反应条件为93 ℃预变性2 min；55 ℃复性20 s，68 ℃延伸20 s，共31个循环。以U6为内参检测miR-4727-5p的表达，以β-actin为内参检测EPS8L3 mRNA的表达。EPS8L3上游引物：5′-AGCCATTTACTTGCACCGGAA-3′，下游引物：5′-CTCCCCTGCTTGCATGTCAT-3′；β-actin上游引物：5′-GGCACCACACCTTCTACAAT-3′，下游引物：5′-GCCTGGATAGCAACGTACAT-3′；miR-4727-5p上游引物：5′-CCACTGTGGAAGCTGGCAGAT-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。采用2-ΔΔCt方法计算miR-4727-5p和EPS8L3 mRNA的表达。

1.5 CCK-8法检测T-47D细胞的增殖

收集miR-4727-5p组和Ctrl组T-47D细胞,分别以每孔2.3×103个细胞接种于96孔板。分别培养1,2,3,4,5 d,每孔加入含5%CCK-8试剂的RPMI-1640培养基,培养箱培养5 h,应用多功能酶标仪分析每孔在490 nm下的光密度值,绘制两组T-47D细胞生长曲线。

1.6 划痕愈合实验检测T-47D细胞的迁移

收集miR-4727-5p组和Ctrl组T-47D细胞,分别以每孔2.3×106个细胞接种于6孔板,T-47D细胞贴壁后,将200 μl枪头在培养板底部均匀划线,用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗,在培养箱中连续培养。分别在划痕0 h和24 h后显微镜下拍照,测量T-47D细胞迁移率。

1.7 生物信息学软件预测和双荧光素酶报告基因实验验证miR-4727-5p的目的靶基因

应用CoGeMiR、MicroRNAdb生物信息学网站预测miR-4727-5p的目的靶基因。将重组质粒miR-4727-5p、空载质粒、EPS8L3野生型质粒和EPS8L3突变型质粒共转染T-47D细胞,分组如下:EPS8L3野生型+空载质粒、EPS8L3野生型+miR-4727-5p、EPS8L3突变型+空载质粒、EPS8L3突变型+miR-4727-5p。培养24 h,裂解各组细胞,加入荧光素酶检测试剂,避光条件下检测各组萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性。

1.8 Western blot检测EPS8L3蛋白和EGFR信号通路蛋白的表达

通过RIPA裂解液提取miR-4727-5p组和Ctrl组T-47D细胞的总蛋白,每组取80 μg蛋白样品在15%的十二烷基苯磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳。硝酸纤维素膜转膜后,于9%脱脂牛奶封闭1.5 h,分别加入一抗p-EGFR(1 ∶1 000)、EPS8L3(1 ∶3 000)、β-actin(1 ∶2 000)、p-Raf1(1 ∶3 000)、p-MEK1(1 ∶2 000),在4 ℃孵育8 h,加入羊抗鼠二抗(1 ∶8 000),室温下孵育1.5 h。滴加化学发光剂,在全自动凝胶成像仪中显影,以β-actin蛋白为内参。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 miR-4727-5p在乳腺癌组织及细胞系中的表达

qRT-PCR检测结果显示,乳腺癌组织和癌旁组织中miR-4727-5p表达分别为1.00±0.07和6.38±0.54,与癌旁组织比较,乳腺癌组织中miR-4727-5p表达水平明显降低(P<0.01,见图1)。qRT-PCR检测结果显示,与MCF-10A细胞相比,乳腺癌细胞系MB-MDA-468、SKBR3、MCF-7、T-47D中miR-4727-5p的表达均显著下降(均P<0.05),T-47D细胞中miR-4727-5p表达水平最低(P<0.01,见图2),因此后续实验采用T-47D细胞进行研究。结果表明,miR-4727-5p在乳腺癌组织和细胞系中均呈低表达。

与癌旁组织相比,**P<0.01图1 乳腺癌组织和癌旁组织中miR-4727-5p的表达Figure 1 Expression of miR-4727-5p in breast cancer tissues and adjacent tissues

与MCF-10A细胞相比,*P<0.05,**P<0.01图2 乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞中miR-4727-5p的表达Figure 2 Expression of miR-4727-5p in breast cancer cells and normal mammary epithelial cells

2.2 转染后T-47D细胞中miR-4727-5p的表达

qRT-PCR检测结果显示,Ctrl组和miR-4727-5p组T-47D细胞中miR-4727-5p的表达分别为0.28±0.05和1.06±0.07,与Ctrl组比较,miR-4727-5p组T-47D细胞中miR-4727-5p表达明显升高(P<0.01)。

2.3 miR-4727-5p对T-47D细胞增殖能力的影响

CCK-8法实验结果显示,转染miR-4727-5p第2,3,4,5天时,与Ctrl组相比,miR-4727-5p组T-47D细胞的增殖能力明显下降(P<0.05,见图3),提示过表达miR-4727-5p抑制了T-47D细胞的增殖。

2.4 miR-4727-5p对T-47D细胞迁移能力的影响

划痕愈合实验结果显示,Ctrl组和miR-4727-5p组细胞迁移率分别为72.56%±3.59%和29.40%±5.01%,与Ctrl组相比,miR-4727-5p组细胞迁移率明显下降(P<0.01,见图4),提示过表达miR-4727-5p抑制了T-47D细胞的迁移。

与Ctrl组相比,*P<0.05,**P<0.01图3 过表达miR-4727-5p对T-47D细胞增殖能力的影响Figure 3 Effect of miR-4727-5p overexpression on the proliferation ability of T-47D cells

2.5 miR-4727-5p靶向结合EPS8L3 mRNA

CoGeMiR、MicroRNAdb生物信息学网站预测结果显示,miR-4727-5p与EPS8L3 mRNA存在结合位点,两者之间可能互补结合(见图5)。双荧光素酶报告基因实验显示,EPS8L3野生型+miR-4727-5p组细胞荧光信号明显低于EPS8L3野生型+空载质粒组(P<0.01),而EPS8L3突变型+空载质粒组与EPS8L3突变型+miR-4727-5p组荧光信号差异无统计学意义(P>0.05,见图6)。以上结果表明,EPS8L3是miR-4727-5p的目的靶基因。

图4 过表达miR-4727-5p对T-47D细胞迁移能力的影响Figure 4 Effect of miR-4727-5p overexpression on the migration ability of T-47D cells

图5 miR-4727-5p与EPS8L3 mRNA的互补结合位点Figure 5 The complementary binding site of miR-4727-5p and EPS8L3 mRNA

2.6 miR-4727-5p对EPS8L3 mRNA表达的影响

qRT-PCR实验结果显示,Ctrl组和miR-4727-5p组T-47D细胞中EPS8L3 mRNA表达分别为6.31±0.98和1.02±0.30,miR-4727-5p靶向下调EPS8L3 mRNA的表达(P<0.01)。

2.7 miR-4727-5p对EPS8L3蛋白和EGFR信号通路蛋白表达的影响

Western blot实验显示,与Ctrl组比较,miR-4727-5p组T-47D细胞中EPS8L3蛋白表达下调,EGFR信号通路蛋白如p-EGFR、p-Raf1、p-MEK1表达下调(见图7)。

与EPS8L3野生型+空载质粒组相比,**P<0.01图6 双荧光素酶报告基因实验验证miR-4727-5p与靶基因的结合Figure 6 Verification of the binding of miR-4727-5p to the target gene by dual luciferase reporter gene experiment

图7 miR-4727-5p对T-47D细胞EPS8L3蛋白和EGFR信号通路蛋白表达的影响Figure 7 Effect of miR-4727-5p on the expression of EPS8L3 protein and EGFR signaling pathway proteins in T-47D cells

3 讨论

miRNA含有应答元件,其能够特异性结合目的靶基因的mRNA,对靶基因进行负调控[9-11]。近年来研究显示,miRNA在乳腺癌细胞浸润、化疗药物抗性、干细胞性等过程中起到关键作用[12,13]。不同miRNA在乳腺癌组织中的表达和功能呈显著差异[14]。Fan等[15]报道,与癌旁正常乳腺组织相比,乳腺癌组织中miR-22-3p表达显著降低,过表达miR-22-3p通过靶向多形性腺瘤基因样蛋白2(pleomorphic adenoma gene-like protein 2,PLAGL2)抑制MCF-7细胞的增殖。Jia等[16]报道,与健康乳腺组织相比,乳腺癌组织中miR-150-5p表达降低,并且miR-150-5p低表达与乳腺癌患者的总体生存率较差有关,miR-150-5p能够抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化。Nafea等[17]报道,miR-939-5p在乳腺癌组织中表达下调,通过抑制白细胞介素10和肿瘤坏死因子α表达,参与乳腺癌肿瘤微环境的免疫调节。本研究发现,miR-4727-5p在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中均表达降低,表明miR-4727-5p可能发挥抑癌效应。本研究应用转染技术过表达miR-4727-5p后,T-47D细胞的增殖和迁移能力明显降低,miR-4727-5p在乳腺癌细胞中可能发挥抑癌作用。

本研究通过CoGeMiR、MicroRNAdb生物信息学网站预测,表皮生长因子受体激酶底物8样蛋白3(epidermal growth factor receptor kinase substrate 8-like protein 3,EPS8L3)可能是miR-4727-5p的下游靶基因。EPS8L3蛋白属于表皮生长因子受体激酶底物8样蛋白家族,由磷酸结合蛋白结构域、真核生物蛋白结构域、效应蛋白结构域三部分组成,与细胞凋亡、代谢、增殖等过程相关[18]。研究显示,EPS8L3蛋白在肝癌、前列腺癌等实体瘤中表达显著上调,与肿瘤分级、患者死亡率密切相关,EPS8L3高表达的患者生存期较短[19,20]。双荧光素酶报告基因实验结果显示,miR-4727-5p能够与EPS8L3 mRNA互补结合。过表达miR-4727-5p的乳腺癌细胞T-47D细胞中EPS8L3 mRNA和蛋白表达明显降低,均提示EPS8L3是miR-4727-5p的下游靶基因。有研究表明,EPS8L3蛋白主要通过激活EGFR信号通路,在肿瘤发生和进展中起到关键作用[21]。本研究显示,miR-4727-5p靶向下调EPS8L3蛋白表达后,EGFR信号通路蛋白如p-EGFR、p-Raf1、p-MEK1表达下调,进一步提示miR-4727-5p发挥抑癌作用与下调EPS8L3蛋白表达有关。

综上所述,miR-4727-5p在乳腺癌组织和细胞系中呈低表达,miR-4727-5p通过负向调控EPS8L3基因的表达下调EGFR信号通路活性,从而抑制乳腺癌T-47D细胞的增殖和迁移。miR-4727-5p可能作为乳腺癌潜在的诊断标志物和分子治疗靶点。