远志药材薄层色谱自动分析评价方法研究

李勋章,吴 婷,李万敏,邸 学,王海波

(辽宁中医药大学药学院分析实验室,大连 116000;*通讯作者,E-mail:whb-email@126.com)

远志为远志科植物远志(PolygalatenuifoliaWilld.)或卵叶远志(Polygala.sibiricalL.)的干燥根[1],具有安神益智、祛痰、消肿的作用,广布全国各地,以西南和华南地区最盛[2]。远志鉴别方法主要有薄层色谱法[3-5]、高效液相色谱法[6-12]。其中,薄层色谱法具有快速有效、价格低廉、高通量等特点,通过人眼观察比较不同条带斑点进行定性分析。刘艳丽等[4]和范梅娟等[13]采用薄层色谱对远志进行鉴别,但条带斑点多、颜色复杂,仅少量有对应特征斑点能选取作为特征斑点来简单比较样品之间关系。

近年来,随着计算机技术的快速发展,自动分析技术在中药领域中也逐渐被应用[14,15]。以远志对照药材、不同产地的远志饮片及同科植物的薄层色谱图为对象,进行智能分析方法研究。此方法能避免人眼对相近颜色的识别误差,更好地处理样品条带颜色信息,提高色彩识别灵敏度。本文采用自动分析方法,利用计算机图像分析技术,将薄层色谱图像信号转换为数字信号进行分析处理,更加全面客观地呈现样本间薄层色谱斑点结果情况,为远志的真伪鉴别准确性和质量等级自动化控制评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

2F-2C型暗箱式自动紫外分析仪(上海市安亭电子仪器厂);B-260恒温水浴锅,移液枪(上海苏阳仪器有限公司);KQ5200DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);Linomat5半自动点样仪(瑞士卡玛公司);ACCULABALC-110.4万分之一天平(德国sartorius,型号:ALC-110.4)。

1.2 试药

硅胶G(中国青岛海洋化工);甲醇(分析纯,天津市富宇精细化工有限公司);纯净水(辽东半岛饮用纯净水有限公司);三氯甲烷、乙酸乙酯(分析纯,天津市凯信化学工业有限公司);远志对照药材(批号:120989-201107,中国食品药品检定研究院);17批远志样品(S1～S17)及小金牛草(S18)来源信息见表1。经辽宁中医药大学邸学高级实验师鉴定,17批远志样品均为远志科植物远志(PolygalatenuifoliaWilld.)的干燥根,小金牛草为远志科植物小花远志(PolygalatelephioidesWilld.)的全草。

表1 远志药材产地信息表

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 样品溶液的制备 取不同远志样品粉碎,精密称定粉末0.5 g,置具塞锥形瓶中,加70%甲醇15 ml,超声处理30 min,滤过,滤液水浴蒸干,残渣加甲醇1 ml溶解,作为供试品溶液。

2.1.2 薄层层析条件 用硅胶G铺板,105 ℃活化30 min,以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 ∶40 ∶22 ∶10,4 ℃静置30 min的下层溶液)为展开剂。

2.1.3 薄层色谱测定方法 照《中国药典》项下薄层色谱鉴别方法(通则0502)试验[16],分别吸取对照品溶液与供试品溶液各2 μl,点于同一硅胶G薄层板上,展开、取出、晾干、在紫外灯光(366 nm)下检视,结果见图1。薄层板检视拍照,图像保存为JPG格式。

1-4，6-9，11-14，16-20.S1～S17；5，15.对照药材；10.S18图1 18批远志药材薄层色谱图Figure 1 TLC of 18 batches of Radix Polygala

2.2 薄层色谱目视观察

远志样品在比移值(Rf)0.8处,可见清晰强蓝色荧光斑点;在Rf 0.3～0.5处可见淡蓝色荧光斑点,各远志样品颜色强度相似。伪品S18样品在Rf 0.8处有浅蓝色荧光斑点,在Rf 0.4～0.6处有密集红色荧光斑点,在Rf 1.0处有强红色荧光斑点,与远志对照品不一致。

2.3 薄层色谱自动分析

对薄层展开条带进行自动取色分析,采用相似度和聚类分析判断远志样品之间的相关性和分类情况。

2.3.1 色值处理 按条带位置及展开高度对图像取色区域进行划分,通过取色软件对彩色图像进行16进制代码的颜色输出,改变色彩模式表达,计算每个像素点的总色值。

2.3.2 薄层条带色值自动分析 打开软件,设置自动选点、取色、复制颜色代码的操作脚本,对拍照图片进行自动取色及颜色信息汇总,进行相似度和聚类分析。

2.4 自动分析方法学考察

2.4.1 取样量考察 取相同批次远志样品0.2,0.5,0.8,1.0 g,按2.1.1项下方法制备供试品溶液,点样展开。展开后,按2.3项下方法进行自动分析。确定远志样品取样量为0.5 g,条带清晰,斑点圆整,结果见图2A。

2.4.2 点样量考察 取相同批次远志样品0.5 g,按2.1.1项下方法制备供试品溶液进行点样展开,点样量分别为1,2,3 μl,进行展开。按2.3项下方法进行自动分析。确定点样量为2 μl时,色谱斑点清晰,自动取色分析结果好,结果见图2B。

1-4.分别为样品量0.2,0.5,0.8,1.0 g A.取样量考察结果 1-3.分别为点样量1,2,3 μl B.点样量考察结果

2.4.3 精密度试验 取相同批次远志样品0.5 g,按2.1.1项下方法制备供试品溶液进行点样展开,共点8个条带,点样量为2 μl,按2.3项下方法对8个条带分别进行自动分析。结果表明,8个条带相似度RSD(n=6)分别为0.27%,0.91%,0.37%,0.71%,0.84%,0.80%,0.36%,1.42%,表明该方法精密度良好。

2.4.4 重复性试验 取5批远志样品0.5 g,按2.1.1项下方法制备供试品溶液进行点样展开,点样量为2 μl,按2.3项下方法进行取色分析,共分析6次。结果表明,6次分析后的条带相似度RSD(n=6)分别为0.59%,1.42%,0.69%,0.84%,0.87%,表明本方法重复性良好。

2.4.5 取色高度考察 取相同远志样品0.5 g,按2.1.1项下方法制备供试品溶液进行点样展开,点样量为2 μl,共点3个条带。按2.3项下操作对其进行取色分析,条带取色分析高度间距分别为2像素、3像素、4像素重复进行相似度分析。结果表明,取色高度间距为3像素时,色谱条带分析结果好。

2.4.6 取色位置考察 取相同远志样品0.5 g,按2.1.1项下方法制备供试品溶液进行点样展开,点样量为2 μl,共点4个条带。取色分析时,分别取条带中心位置、三等分位、五等分位、五等分中间三位。按2.3项下操作对其进行取色分析,相同高度的取色点色值取平均值,进行相似度考察。结果表明,取色宽度为五等分中间三值的平均值,结果最好。

2.5 相似度评价

将20批远志薄层颜色信息导入SPSS 22.0系统中进行Spearman相关性分析,计算远志样品与对照药材颜色数据之间的相似度。17批远志样品与对照药材相似度为0.851～0.955,伪品S18与标准品相似度为0.445(见表2)。说明该方法可鉴别出远志药材伪品。

表2 18批样品与对照药材相似度评价结果

按照相似度划分等级,大于0.93为一等品有5批(S3、S9、S10、S11、S13);大于0.89为二等品有6批(S1、S4、S6、S12、S14、S16);大于0.85为三等品有6批(S2、S5、S7、S8、S15、S17)。17批远志样品虽在肉眼观察下近似一致,但经自动分析后,可根据相似度差异进行等级划分。

2.6 聚类分析

以18批远志薄层颜色数据为原始数据,运用SPSS 22.0软件进行系统聚类分析见图3。根据Pearson相关性分析,将对照药材1、对照药材2、S1、S15、S17样品聚为一类,S2～S14、S16样品聚为一类,S18样品单独为一类(见图3A)。

采用相同聚类条件分析176个样品点,共聚成7类,分别与条带Rf值相对应。条带上1～9斑点(Rf:0.005～0.051)聚为一类,分为第一区域;条带上10～32斑点(Rf:0.056～0.182)聚为一类,分为第二区域;条带上33～50斑点(Rf:0.188～0.284)聚为一类,分为第三区域;条带上51～93斑点(Rf:0.290～0.528)聚为一类,分为第四区域;条带上94～145斑点(Rf:0.534～0.824)聚为一类,分为第五区域;条带上146～150斑点(Rf:0.830～0.852)聚为一类,分为第六区域;条带上151～176斑点(Rf:0.858～1.000)聚为一类,分为第七区域(见图3B)。

A.18批远志样品结果 B.远志条带176个斑点结果图3 远志样品聚类分析结果图Figure 3 Cluster analysis results of Radix Polygala samples

2.7 样品条带色谱斑点主成分综合评分

采用SPSS统计软件对17批样品的176个样品点进行主成分分析,得到各取色点的综合评分,部分结果见表3。结果表明,176个样品点综合评分高的前24个点主要分布在第七区域,其次分布在第三、第五两个区域,剩余四个区域的样品点综合得分接近于0。由此推测,Rf:0.188～0.284、Rf:0.534～0.824、Rf:0.830～0.852这三个区域可能对样品聚类分析有明显的影响。

3 讨论

使用自动分析与目视比较法同时对图1进行分析。结果表明,通过目视比较法得出S18样品为伪品小金牛草,S6样品斑点较少,S2、S7、S12、S16、S17样品的斑点比较多,各远志样品与对照药材在Rf为0.5～0.8之间有不明显斑点。采用本实验建立的薄层色谱自动分析方法对18批远志样品进行定性鉴别,分析比较18批远志样品与对照药材之间的色谱条带数值相似度,发现S18样品为伪品小金牛草,其余17批远志样品与对照药材的相似度均高于0.85,说明17批远志样品均一性较好;并根据相似度结果对各个样品进行等级划分:相似度大于0.93为一等品有5批,大于0.89为二等品有6批,大于0.85为三等品有6批。

表3 176个样品点综合评分结果

主成分综合评分高的24个样品点集中分布在第三、第五、第七3个区域。第七区域的样品点是远志样品聚类分析结果的主要影响因素,第三、第五2个区域对分析结果也存在明显影响;其中第五区域Rf:0.534～0.824在目视比较时,仅有不明显暗斑,各条带间无明显差异;但采用自动分析法时,第五区域对条带间相似性存在明显影响。

对自动分析相似度值的影响因素除17批远志样品质量存在差异外,薄层图谱条带是否规整、拍照角度是否垂直、薄层板是否有边缘效应、斑点条带荧光亮度等都会对相似度评价以及聚类分析类别划分产生明显影响,且斑点圆整性、背景颜色、展开距离、点样点大小等也会对自动分析数据处理结果产生一定程度上的干扰。

本方法通过对薄层板颜色识别,可用于不同品种远志的定性鉴别,克服人眼对相近颜色识别误差,准确性好,且适用广泛;对条带数目多、斑点复杂的薄层板鉴别灵敏度高,条带间相似度判断准确,实现了薄层结果自动、直观、数据化分析,使结果更加准确。同时可对市售不同品种不同来源的远志进行等级划分,为远志的等级划分也提供参考依据,为进一步完善远志药材的质量评价方法提供研究依据,有助于远志品种质量评价标准的提高。