子宫内膜癌细胞外泌体长链非编码RNA-C00473对人脐静脉内皮细胞VEGF和VEGFR-2表达的影响

贺 新,兰 飞,马 媛,张义灵*

(1空军军医大学唐都医院肿瘤科,西安 710038;2空军军医大学唐都医院妇产科;*通讯作者,E-mail:zhyiling84816@163.com)

子宫内膜癌(endometrial carcinoma, EC)作为好发的妇科恶性肿瘤疾病,其发病机制不清[1],且目前尚无较为有效的无创性早期预测、诊断方法。不少EC病例发现时已处肿瘤进展晚期,或多部位转移等情况,影响整体预后。因此,寻找和探索EC疾病标记物具有重要意义。

我们前期研究[2]中发现在EC组织中lncRNA-C00473病理性高表达,其能够通过微小RNA15b(miR-15b)/细胞周期蛋白D1(cyclin D1)途径,发挥部分调节作用,影响Ishikawa细胞增殖能力;初步明确了lncRNA-C00473、miR-15b与EC的相关性。而源自于循环系统的外泌体(exosomes,exo)中富含包括lncRNA、miRNA在内的多种成分,能够通过转运至效应器官/组织细胞,在妇科恶性肿瘤疾病产生、进展过程中发挥诸多的生理调控作用[3]。因此,本文拟探讨EC组织中高表达的lncRNA-C00473能否以被外泌体装载的方式作用于其他组织细胞,从而在EC的发生、转移过程中发挥相关作用。

1 材料和方法

1.1 临床样本

收集2019年10月至2020年5月在空军军医大学唐都医院妇产科因子宫内膜癌住院进行手术治疗的患者15例为子宫内膜癌组,该组患者术后离体标本均证实:肿瘤病灶局限于子宫体,病理类型为内膜样癌(细胞分化≤G2中分化),并依据FIGO(Fede-ration international of gynecology and obstetrics,FIGO)2009子宫内膜癌手术病理分期标准提示≤Ⅱ期;选取同期因妇科良性疾病(术后病理证实为子宫肌瘤或子宫腺肌症)且无任何其他妇科合并症的住院接受手术治疗患者15例为对照组。两组患者入院前均未接受任何治疗,既往无遗传性、传染性疾病及代谢性疾病病史;无慢性病药物使用、放射线及毒物接触史。本研究经我院伦理委员同意并批准,所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要细胞、试剂和材料

Ishikawa细胞、HUVEC细胞由空军军医大学唐都医院妇产科实验室惠赠。RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素(美国Gibco公司);磷酸缓冲盐溶液(PBS)(武汉普诺赛科技有限公司);exoEasy Maxi Kit外泌体提取试剂盒(德国Qiagen公司);exoRNeasy Serum(德国Qiagen公司);PKH26染料(美国sigma公司);PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit(日本Takara公司);Lipofectamine 2000(美国ThermoFisher公司);pcDNA3.1-C00473、siRNA-C00473质粒(广州吉赛生物科技股份有限公司);TRIzol(美国invitrogen公司);PCR引物序列(中国擎科生物有限公司);RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国碧云天公司);CD63多克隆抗体(中国武汉三鹰公司);CD9单克隆抗体(英国Abcam公司);VEGF、VEGFR-2、β-actin单克隆抗体、HRP标记二抗(武汉博士德生物工程有限公司);PVDF膜(美国Millipore公司);ECL底物液(北京普利莱基因技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 血清标本收集 入院后在接受药物及手术治疗前，分次采集、收集纳入患者晨起空腹静脉血共计10 ml。所有血浆样本均在采集后置促凝管中，4 ℃静置过夜后2 000 r/min离心5 min，吸取上层血清至EP管中，-80 ℃冰箱保存备用。以备提取外泌体及外泌体中总RNA，拟后续实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)检测正常子宫内膜患者与子宫内膜癌患者血清外泌体中lncRNA-C00473表达水平。

1.3.2 细胞培养及转染 将Ishikawa细胞取出后解冻后复苏，接种于含10%FBS、1%青霉素-链霉素的RPMI-1640培养基中，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下培养。取对数生长期细胞，用RPMI-1640培养基制成单细胞悬液，按每孔2×105个细胞量，均匀地接种于6孔板中，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件培养过夜；待细胞生长密度至80%左右时按照Lipofectamine 2000说明书要求行转染实验。

将Ishikawa细胞进行如下分组:过表达组(转染pcDNA3.1-C00473)、抑制组(转染siRNA-C00473)、空白组(未行转染)。脂质体法转染后6 h于荧光显微镜下观察转染效率;48 h后Trizol法提取各组Ishi-kawa细胞中总RNA,检测RNA质量后,按照PrimeScript RT reagent kit、SYBR Premix Extaq RT-PCR kit说明书步骤进行RT-qPCR,检测lncRNA-C00473转染后mRNA水平的表达情况(即转染效率检测)。引物序列见表1。反应条件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,55 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s,40个循环。以U6为内参,进行PCR反应。每次检测设定3个复孔,每个样本重复3次。根据PCR扩增曲线,使用2-ΔΔCt法计算各组中目的基因lncRNA-C00473 mRNA水平的表达情况。

检测细胞转染效率后,PBS液涮洗各组细胞,并加入无外泌体血清的完全培养基,24 h后收集并保存培养上清液,备后续实验所用。

表1 目的基因引物序列

1.3.3 外泌体提取、鉴定 使用0.8 μm的滤膜过滤1.3.1中收集的血清标本，按照exoEasy Maxi Kit说明书步骤将过滤后血清与缓冲液1 ∶1混合，倒置混合均匀后加入至exoEasy自旋柱上，2 000 r/min离心1 min；收集离心液并加入缓冲液，5 000 r/min离心5 min；将旋转柱转移到新的收集管中，加入400 μl缓冲液孵育1 min，500 r/min离心5 min，磷酸盐缓冲液重悬离心沉淀，依据血清标本来源(子宫内膜癌组/对照组患者血清)得到两组不同来源的外泌体(研究组exo、对照组exo)，留存备测。同样方法提取1.3.2中进行转染实验后的三组Ishikawa细胞培养上清中外泌体，留存备测。

使用Nanosight NS300系统进行外泌体纳米颗粒跟踪分析技术(nanosight tracking analysis,NTA)鉴定,PBS缓冲液多次稀释外泌体样本,直至影像学判断样品于合适浓度下观察;依据收集的影像动态记录片段,分析测量外泌体样本颗粒粒径(nm)及对应颗粒浓度(颗粒个数/ml)。

使用2.5%的戊二醛4 ℃下固定两组外泌体;2%锇酸溶液室温下再次固定;梯度乙醇脱水;812包埋剂渗透过夜;包埋板切片(成片厚度60～80 nm);2%醋酸铀饱和水溶液及枸橼酸铅,染色切片后室温干燥过夜;最后于透射电镜下拍照。

1.3.4 外泌体细胞摄取实验及特征性蛋白检测 取对数生长的HUVEC细胞，消化并稀释细胞浓度至2×105个/ml，并制备细胞爬片；将Ishikawa细胞培养上清外泌体与PKH26染液(可荧光标记活体细胞且不影响细胞功能)共孵育，共孵育后培养基重悬，加入HUVEC细胞爬片中再次孵育。根据孵育过程中添加外泌体的来源不同进行HUVEC细胞分组：过表达Exo组(添加C00473过表达组血清Exo)、抑制Exo组(添加C00473抑制组血清Exo)、对照组(添加未转染组血清Exo)。随后PBS液洗涤爬片4%多聚甲醛固定，DAPI染核；置于荧光显微镜下观察并照相。

RIPA裂解液分别提取血清标本及各组Ishikawa细胞外泌体总蛋白;检测蛋白浓度后,Western blot检测外泌体特征性蛋白(CD9、CD63):配胶后十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE);将目的条带电转至PVDF膜;一抗4 ℃孵育过夜(抗体浓度:外泌体特征性蛋白CD9 1 ∶2 000、CD63 1 ∶400;内参GAPDH 1 ∶1 500);HRP标记二抗(1 ∶50 000)室温孵育2 h;ECL显影、定影,BandScan分析胶片灰度值。

1.3.5 血清标本外泌体中lncRNA-C00473在mRNA水平的表达检测 按照exoRNeasy Serum说明书步骤分别提取血清标本外泌体中总RNA;检测RNA质量后,同1.3.2中方法及反应条件进行RT-qPCR实验。引物序列见表1。每次检测设定3个复孔,每个样本重复3次。根据PCR扩增曲线,使用2-ΔΔCt法计算各组中目的基因lncRNA-C00473 mRNA水平的表达情况。

1.3.6 qRT-PCR和Western blot检测各组HUVEC细胞中VEGF、VEGFR-2表达情况 各组HUVEC总RNA提取及qRT-PCR实验步骤同1.3.5中,VEGF、VEGFR-2引物序列见表1。反应条件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s,40个循环。以β-actin为内参,进行PCR反应。每次检测设定3个复孔,每个样本重复3次。根据PCR扩增曲线,使用2-ΔΔCt法计算各组中目的基因VEGF、VEGFR-2 mRNA水平表达情况。

HUVEC细胞分为3组,具体分组处理方式,以及各组细胞总蛋白提取、Western blot实验步骤同1.3.4中,VEGF、VEGFR-2、β-actin一抗浓度分别为1 ∶1 000,1 ∶800和1 ∶500;HRP标记二抗浓度为1 ∶10 000。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 血清外泌体中lncRNA-C00473的表达情况

qRT-PCR结果显示,与正常子宫内膜相比,子宫内膜癌患者血清外泌体中lncRNA-C00473的表达增高(P<0.05,见图1)。

与正常子宫内膜患者相比,*P<0.05图1 两组患者血清外泌体中lncRNA-C00473的相对表达Figure 1 The relative expression of lncRNA-c00473 in serum exosomes in two groups

2.2 Ishikawa细胞转染效率检测

qRT-PCR结果显示,与空白组相比,lncRNA-C00473在过表达组中表达显著升高,在抑制组中表达显著降低(均P<0.05,见图2)。

与空白组相比,*P<0.05图2 三组Ishikawa细胞中lncRNA-C00473的相对表达Figure 2 The relative expression of lncRNA-c00473 in Ishikawa cells in three groups

2.3 外泌体鉴定及细胞摄取实验

NTA鉴定结果显示,血清外泌体(Exo)及Ishikawa细胞培养上清中外泌体的粒径大小均主要集中于30～200 nm范围内;血清外泌体及Ishikawa细胞培养上清中外泌体的粒子浓度分别为2.84×109particles/ml和2.31×109particles/ml。

于透射电镜下观察血清标本中所提取的血清Exo及Ishikawa细胞培养上清Exo,可见其外泌体形态均为典型囊泡状,圆盘双凹形;直径大小大多位于150～500 nm范围内(见图3)。

图3 血清Exo及细胞培养上清Exo透射电镜下形态Figure 3 Morphology of serum Exo and cell culture supernatant Exo under transmission electron microscope

Western blot结果显示,血清Exo及细胞培养上清Exo均可表达外泌体表面特征性蛋白CD9、CD63(见图4)。

图4 Western blot检测血清及细胞培养上清外泌体中CD9、CD63蛋白的表达Figure 4 The expression of CD9 and CD63 proteins in exosomes of serum and cell culture supernatant detected by Western blot

外泌体细胞摄取实验结果显示,PKH26染色标记的Ishikawa细胞培养上清外泌体与HUVEC细胞共培养孵育后,能够被HUVEC细胞摄取,通过荧光显色可见到进入HUVEC细胞内的外泌体(见图5)。

2.4 qRT-PCR和Western blot检测各组HUVEC细胞中VEGF、VEGFR-2表达情况

qRT-PCR和Western blot结果显示,与对照组比较,过表达Exo组VEGF、VEGFR-2在mRNA和蛋白水平均升高(均P<0.05);抑制Exo组细胞中VEGF、VEGFR-2在在mRNA及蛋白水平表达均降低(P<0.05,见表2、图6)。

红色荧光提示HUVEC细胞能够摄取外泌体至胞质内图5 HUVEC细胞摄取外泌体荧光检测Figure 5 Fluorescent staining of exosomes uptaken by HUVEC cells

表2 qRT-PCR和Western blot检测三组HUVEC细胞中VEGF及VEGFR-2在mRNA和蛋白水平的相对表达量

图6 Western blot检测三组HUVEC细胞中VEGF和VEGFR-2蛋白的表达Figure 6 The expression of VEGF and VEGFR-2 proteins in HUVEC cells in three groups by Western blot

3 讨论

子宫内膜癌(EC)作为女性常见妇科恶性肿瘤,其年发病率达3.4%[4],因具有异质性的特点[5],故而患病群体个体化差异较大。80%左右的EC为雌激素相关性肿瘤,但目前其具体发病机制尚不明确。代谢障碍、激素环境等因素,以及与之相关的非编码RNA、外泌体等[6],均在EC的发生、进展过程中发挥了重要作用。早期EC治疗效果较好,但因临床症状不明显,多数EC发现时已合并转移,且晚期患者预后较差,因此早期发现、治疗及探寻新型标志物十分重要。

作为细胞间的“通讯使者”,外泌体直径仅为30～100 nm,其存在于女性生殖系统相关的各种组织、体液、细胞中,并携带脂质组、蛋白质、核酸物质、非编码RNA[7]等,以发挥其病理及生理调节作用[8]。在外泌体所携带的各类分子成分中,lncRNA-miRNA构成的网络系统能够发挥对下游基因的定向调控作用,参与多种病理生理过程,已经在EC病因研究领域中得到了明确[9]。我们前期研究发现[2]:在EC组织中lncRNA-C00473存在病理性表达,其能够通过miR-15b/cyclin D1发挥部分调节作用,影响Ishi-kawa细胞增殖能力。提示lncRNA-C00473与miR-15b之间构成的调节系统在EC发病中起到了一定作用。但是,EC相关的差异性表达的lncRNA-C00473是在EC组织中所发现,组织中的差异表达趋势是否也同样存在于血清外泌体中?本研究中我们进一步检测了EC患者血清外泌体中lncRNA-C00473的表达情况,结果提示:与正常组相比,研究组lncRNA-C00473 mRNA表达水平在血清外泌体中升高(P<0.05);这与前期研究中,在EC组织中发现的差异表达趋势一致;进一步验证了lncRNA-C00473与EC的相关性以及它们有成为疾病标志物的潜力;提示lncRNA-C00473可能由子宫内膜癌细胞分泌,并通过外泌体的方式作用于其他部位。

血管生成在包括子宫内膜癌在内的各种肿瘤的进展中起着关键作用[10];而VEGF与其受体(VEGFR-2)结合在这一过程中起到重要作用;此外,通过VEGF/VEGFR-2[11]信号通路,以血管内皮细胞为靶点的药物治疗也逐渐成为癌症治疗中的重要手段[10];而外泌体则在肿瘤的恶性生物学行为(如复发、转移、侵袭正常组织等)过程中发挥相关介质作用[12]。本研究中我们收集了过表达与抑制lncRNA-C00473的Ishikawa细胞分泌的外泌体,随后与HUVEC细胞进行了共孵育。结果发现,HUVEC细胞能够较好地摄取Ishikawa细胞上清中外泌体;并且过表达lncRNA-C00473的Ishikawa细胞上清外泌体能够促进HUVEC细胞中VEGF、VEGFR-2在mRNA和蛋白水平的表达(P<0.05);而抑制lncRNA-C00473的Ishikawa细胞上清外泌体使HUVEC细胞中VEGF、VEGFR-2在mRNA和蛋白水平的表达降低(P<0.05)。结合本研究中发现,提示lncRNA-C00473可能能够以外泌体装载的形式由肿瘤组织前往机体其他组织、部位;伴随EC病情的进展,可能参与了肿瘤新生血管形成、及肿瘤后续转移、侵袭过程。

作为长链非编码RNA,lncRNA-C00473无法直接作用于靶蛋白实现生物学功能,但是其可以通过与miR-15b之间的网络路径发挥其间接调控作用;miR-15b能够调控的靶基因有多种,除我们前期发现的cyclin D1之外,其还可对VEGF[13]及其受体VEGFR-2[14]发挥靶向调节作用。有研究表明,相较于正常子宫内膜组织,EC组织中VEGF、VEGFR-2表达增高[15]。提示EC时高表达的lncRNA-C00473可能以外泌体装载的方式作用于其他部位、组织,进而对miR-15b发挥竞争性调节,从而解除了miR-15b对VEGF、VEGFR-2的靶向抑制作用,导致VEGF、VEGFR-2表达升高,在后续EC肿瘤的转移、侵袭过程中发挥作用。上述过程可能部分解释了本研究中发现的含lncRNA-C00473的Ishikawa细胞上清外泌体影响HUVEC细胞管腔形成能力的相关机制;但是,是否还有其他非编码RNA也参与了上述过程以及涉及的具体机制,是我们后续进一步研究的方向。

综上所述,通过本研究进一步明确了lncRNA-C00473与EC的相关性,以及lncRNA-C00473可能以外泌体装载的方式参与EC发生、发展、转移的过程;因此,为探寻EC疾病标记物及新型药物治疗途径提供了一定理论依据。