SENP1调控CCNE1参与结肠癌的增殖、侵袭和成瘤能力

黄 河,王 磊,巴音达拉,郑广涛,文西年

(新疆医科大学第五附属医院胃肠外科,乌鲁木齐 830054;*通讯作者,E-mail:xinian-wen@163.com)

据2018年全球癌症统计结果显示,结肠癌是全球第四大最常见的癌症,死亡率排位第五[1]。目前结肠癌患者有效的治疗方法包括手术、化疗、射频消融等,这些方法在一定程度上能够有效降低早期结肠癌患者的死亡率,目前结肠癌Ⅰ期患者的5年生存率为92%[2]。但由于结肠癌细胞易发生转移,故其Ⅳ期患者的5年生存率仅为11%,且每年约有20%的结肠癌患者被诊断为Ⅳ期[1]。因此,研究结肠癌发生发展机制,尽早控制结肠癌患者病情进展,是降低结肠癌患者病死率的关键所在。然而,截至目前结肠癌的发病机制仍未完全阐明。

类泛素蛋白修饰(small ubiquitin-like modifier,SUMO)是一种常见的蛋白翻译后修饰方式。SUMO蛋白与其靶蛋白(主要是核蛋白)在特定Lys残基上的共价结合称为SUMO化修饰,SUMO化修饰通过改变蛋白质相互作用来调节修饰靶标的定位[3]。在高等真核细胞中,通常存在3种SUMO蛋白(SUMO1/2/3)和6种SUMO特异性蛋白(Sentrin/SUMO-specific protease, SENP),即SENP1/2/3/5/6/7。在SENPs家族成员中,SENP1在细胞核中广泛分布,也在细胞质中表达,具有解偶联大量SUMO化蛋白和加工前体SUMO产生成熟SUMO的功能[4]。细胞周期蛋白E1(Cyclin E1,CCNE1)是细胞周期G1期调控因子,主要负责调控细胞周期由G0/G1期向S期的转换,从而诱导肿瘤细胞增殖。已知CCNE1在许多肿瘤中过度表达,导致染色体不稳定,最终可能促进肿瘤的增殖[5]。

已有文献报道,SENP1的表达失调与多种癌症(包括结肠癌、前列腺癌等)的发病机制有关[6,7]。此外,SENP1特异性抑制剂已在多种癌症中显示出一定的治疗效果,这表明SENP1可能是治疗癌症的有效潜在治疗靶点。此外,有研究显示,CCNE1的失调与恶性细胞转化有关,在多种类型的肿瘤中均存在CCNE1的过度表达[8,9]。据报道,CCNE1在结肠肿瘤组织中表达量较高[10,11]。然而,关于SENP1对CCNE1的调控作用,以及二者在结肠癌发生中的作用尚未见报道。本文通过比较结肠癌患者结肠癌组织和相应癌旁组织中SENP1和CCNE1的表达的相关性,并分别从细胞水平和动物水平系统论证了SENP1在结肠癌中的作用及其调控CCNE1参与结肠癌的增殖、侵袭和成瘤能力的可能性,旨在探讨SENP1/CCNE1在结肠癌发生发展中的作用,为结肠癌的预防和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

HIEC细胞和结肠癌SW480细胞(百恩维生物科技有限公司),胎牛血清(Gibco公司,美国),DMEM(Gibco公司,美国),培养箱(Thermo公司,美国),甲苯胺蓝(Sigma公司,美国),CCK-8试剂盒(Beyotime,上海,中国),倒置光学显微镜(CarlZeiss公司,德国),Fast SYBR Green PCR试剂盒(Applied biosystems公司,美国),Trizol试剂(Cat#15596026,Invitrogen公司,美国),PrimeScript RT reagent Kit(Cat#RR047A,Takara公司,日本),ABI PRISM 7300 RT-PCR系统(Applied biosystems公司,美国),BCA蛋白定量试剂盒和增强型RIPA裂解液(博士徳公司,武汉,中国),ECL工作液(EMD Millipore公司,美国),SENP1抗体(Cat#ab225887;Abcam,英国),CCNE1抗体(Cat#ab71535;Abcam,英国),β-actin抗体(Cat#ab8227;Abcam,英国),HRP标记的羊抗兔二抗(Cat#ab205719;Abcam,英国)。裸鼠(中国医学科学院北京药理学研究所,北京,中国),辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素蛋白工作液(Cat#0343-10000U,易默生物技术有限公司,北京,中国),DAB(Cat#ST033,威佳科技,广州,中国),山羊血清封闭液(Cat#C-0005,浩然生物科技,上海,中国),苏木素(Cat#PT001,博谷生物科技,上海,中国)。

1.2 方法

1.2.1 临床样本收集 本研究选取2018年6月至2019年6月在新疆医科大学第五附属医院胃肠外科行手术切除的结肠癌患者32例,其中男性18例(56.25%),女性14例(43.75%)。病案室收集患者基本信息,对全部患者进行随访,详细了解患者治疗后情况及临床结局并完善患者临床资料,自手术结束开始随访,随访24个月,Kaplan-Meier法分析SENP1表达与患者总生存期(OS)和无病生存期(DFS)的关系。

1.2.2 细胞筛选、培养与转染 结肠癌SW480细胞用含10%胎牛血清、10 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的DMEM培养,正常人肠上皮HIEC细胞用含10%胎牛血清、10 μg/ml链霉素和100 U/ml青霉素的RPMI-1640培养,SW480和HIEC细胞置于37 ℃、5% CO2的培养箱。在SW480细胞处于对数期时用胰蛋白酶消化细胞,将细胞按每孔1×105个接种于6孔板,常规培养24 h后,待细胞融合度达75%左右,按照Lipofectamine 2000转染说明进行细胞转染。

实验分为:sh-NC组(沉默对照组,在细胞中转染5′-GGGUGAACUCACGUCAGAA-3′)、sh-SENP1-1组(沉默SENP1序列1组,在细胞中转染5′-CACAGGGAAAGCGAGUGGUUGGU-3′)、sh-SENP1-2组(沉默SENP1序列2组,在细胞中转染5′-GAGAGGTAUCUTTUCGUUAUC-3′序列)、sh-SENP1-3组(沉默SENP1序列3组,在细胞中转染5′-GAUCUUGAUAUCCAUGACG-3′),转染48 h后,用RT-qPCR检测sh-SENP1的沉默效率。

1.2.3 RT-qPCR实验检测SENP1、CCNE1 mRNA相对表达量 采用RT-qPCR检测32例结肠癌患者的癌组织及癌旁组织中SENP1 mRNA和CCNE1 mRNA的相对表达量。使用Trizol试剂提取总的RNA,按照PrimeScript RT reagent Kit说明书,取5 μg RNA反转录cDNA,对合成的10 ng cDNA用Fast SYBR Green PCR试剂盒与ABI PRISM 7300 RT-PCR系统进行RT-qPCR检测,每个孔均设置3个重复。β-actin作为内参,采用2-ΔΔCt法分析SENP1、CCNE1基因相对表达量,Ct=(实验组目的基因平均Ct值-实验组管家基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值)。引物设计见表1。

表1 SENP1、CCNE1、β-actin的引物序列

1.2.4 CCK-8法检测细胞活力 将SW480细胞分为sh-NC组和sh-SENP1组,取转染48 h后的细胞,消化重悬,调整细胞浓度为1×105个/ml并以100 μl/孔接种到96孔板中,常规培养过夜。按照CCK-8试剂盒说明书处理细胞,分别在接种后的第24,48,72,96 h,以CCK-8法检测其细胞活力。每次检测时均加入10 μl的CCK-8检测液,放入培养箱中孵育4 h,用酶标仪检测其在450 nm处的吸光度,绘制生长曲线。每次实验重复3次。

1.2.5 流式细胞术检测细胞周期 将SW480细胞分为sh-NC组和sh-SENP1组。取各组对数生长期的各组细胞接种于6孔板(约5×104细胞/孔)。细胞贴壁生长后,弃去培养基,加胰酶,轻拍培养皿充分洗涤,消化收集单细胞悬液。用1 ml预冷的75%酒精在-20 ℃固定过夜。用预冷的PBS清洗两次,加入PI和RNA酶37 ℃避光孵育30 min。流式细胞仪检测细胞G0/G1、S和G2/M周期分布。所有实验均重复3次。

1.2.6 Transwell实验检测细胞侵袭 将SW480细胞分为sh-NC组和sh-SENP1组。侵袭实验:用BD公司的Matrigel包被Transwell小室底部膜的上室面,置于37 ℃孵育1 h使Matrigel聚合成凝胶。细胞在无血清培养基中培养12 h,收获细胞并用无血清培养基重悬(1×105/ml),在下室加入含10%胎牛血清的培养基,取细胞悬液100 μl加入Transwell小室,在37 ℃温育24 h后,将未侵入Matrigel膜表面的细胞用棉签轻轻取下,细胞用100%甲醇固定并用1%甲苯胺蓝染色。染色的侵袭细胞在倒置光学显微镜下观察,随机选取5个区域进行人工计数,每次实验重复3次。

1.2.7 Western blot实验检测SENP1和CCNE1蛋白表达水平 采用Western blot方法检测32例结肠癌患者的癌组织及癌旁组织中SENP1的表达,检测结肠癌细胞以及肠上皮细胞中SENP1的表达。收集结肠癌患者的癌组织及癌旁组织,以及胰蛋白酶消化法收集HIEC细胞和结肠癌SW480细胞,用含有蛋白酶抑制剂的增强型RIPA裂解液进行裂解,然后用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度的测定。蛋白用10% SDS-PAGE进行分离,将分离后的蛋白质电转移到PVDF膜,5% BSA室温封闭2 h以阻断非特异性结合,分别加入稀释的一抗(SENP1,CCNE1,β-actin,均1 ∶500),4 ℃孵育过夜,洗膜后,加入HRP标记的羊抗兔二抗(1 ∶2 000)室温孵育1 h,洗膜后加入ECL工作液,室温孵育转印膜1 min,然后去除多余ECL试剂,保鲜膜密封,暗盒中放上X-ray film曝光5～10 min后进行显影。用Image J分析软件对Western blot图像中各组条带进行灰度定量,β-actin作为内参。每次实验重复3次。

1.2.8 SENP1对SW480细胞体内成瘤的影响 为了研究SENP1调控CCNE1的表达对SW480细胞体内成瘤的影响。取12只SPF级健康裸鼠,6～8周龄,将裸鼠分笼饲养于SPF级动物实验室,实验室湿度60%～65%,温度22～25 ℃,并且在12 h光照和黑暗循环下提供食物和水,适应性饲喂一周后开始实验,实验前观察裸鼠健康状态。本实验程序及动物使用方案已得到动物伦理委员会(20200625181531)的批准。构建慢病毒稳转sh-NC、sh-SENP1的SW480细胞株。将裸鼠随机分为2组,每组6只,在饲养过程中,取各稳转细胞株100 μl皮下注射至裸鼠腋下,对裸鼠进行成瘤侵染,继续饲养6周,对裸鼠实施安乐死,测量肿瘤大小。

1.3 统计学分析

本研究资料统计分析均采用SPSS 21.0(IBM,美国)统计软件进行分析。计量资料以平均值±标准差表示,32例结肠癌患者癌组织与癌旁组织间的比较采用非配对t检验,多组间比较采用单因素方差分析,不同时间点多组数据比较采用重复测量数据的方差分析,Tukey’s进行事后检验。采用Kaplan-Meier法计算患者的生存率,用Log-rank检验进行单因素分析。Pearson相关性分析观察SENP1和CCNE1表达量的相关性。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SENP1和CCNE1在结肠癌组织中高表达

与癌旁组织相比,结肠癌组织中SENP1和CCNE1 mRNA表达升高(SENP1:t=15.465,P<0.05;CCNE1:t=11.213,P<0.05;见图1),SENP1和CCNE1蛋白表达升高(SENP1:t=19.282,P<0.05;CCNE1:t=7.213,P<0.05;见图1)。

与癌旁组织比较,*P<0.05图1 SENP1和CCNE1在肿瘤组织及癌旁组织中的表达 (n=32)Figure 1 Expression of SENP1 and CCNE1 in cancer tissues and adjacent tissues (n=32)

2.2 SENP1和CCNE1 mRNA表达相关性分析

相关性分析结果显示:在结肠癌组织中,SENP1 mRNA与CCNE1 mRNA表达量正相关(r=0.401 7,P=0.022 7,n=32,见图2)。

2.3 Kaplan-Meier法分析SENP1表达与患者预后的关系

生存分析结果显示:SENP1高表达组患者OS、DFS均明显低于SENP1低表达组(OS:χ2=11.272,P=0.001;DFS:χ2=5.575,P=0.018,见图3),提示SENP1高表达与不良预后有关。

图2 SENP1和CCNE1的mRNA表达相关性分析 (n=32)Figure 2 Correlation analysis between mRNA expression of SENP1 and CCNE1 (n=32)

2.4 SENP1在结肠癌细胞系及正常细胞中的表达

与正常肠道细胞HIEC相比,结肠癌细胞SW480中SENP1 mRNA表达量升高(t=14.241,P<0.01,n=3);结肠癌细胞SW480中SENP1蛋白表达量升高(t=12.213,P<0.01,n=3,见图4)。结果表明:SENP1在结肠癌细胞中高表达。

2.5 沉默SENP1后SW480细胞中SENP1的表达降低

与sh-NC相比,sh-SENP1-1组、sh-SENP1-2组和sh-SENP1-3组SW480细胞中SENP1的表达均降低,差异具有统计学意义(F=9.426,P=0.015,n=3),其中sh-SENP1-2组中SENP1的表达最低(见图5),故后续选用sh-SENP1-2组序列对SENP1进行沉默。

图3 Kaplan-Meier法分析SENP1表达与患者总生存期(OS)和无病生存期(DFS)的相关性Figure 3 Correlation between SENP1 expression and OS and DFS of patients by Kaplan-Meier method

与SENP1细胞相比,*P<0.05图4 Western blot检测SW480和HIEC细胞中SENP1蛋白和mRNA表达 (n=3)Figure 4 SENP1 protein and mRNA expression in SW480 and HIEC cells by Western blot (n=3)

2.6 沉默SENP1对SW480细胞增殖能力的影响

转染后96 h,与sh-NC组相比,sh-SENP1组SW480细胞增殖能力降低,差异具有统计学意义(t=13.499,P<0.05,n=3,见图6)。

2.7 沉默SENP1对SW480细胞侵袭能力的影响

与sh-NC组相比,sh-SENP1组SW480细胞侵袭数目降低,差异具有统计学意义(t=15.839,P<0.05,n=6,见图7)。

与sh-NC组相比,*P<0.05图5 RT-qPCR检测沉默SENP1后SW480细胞中SENP1的表达 (n=3)Figure 5 SENP1 expression in SW480 cells after silencing SENP1 by RT-qPCR (n=3)

与SENP1细胞相比,*P<0.05图6 CCK-8法检测SW480细胞增殖情况 (n=3)Figure 6 Cell proliferation of SW480 by CCK-8 method (n=3)

与sh-NC组相比,*P<0.05图7 Transwell检测SW480细胞侵袭数目 (n=6)Figure 7 Invasion capacity of SW480 cells by Transwell (n=6)

2.8 沉默SENP1对SW480细胞周期的影响

与sh-NC组相比,sh-SENP1组G0/G1周期细胞比例增加,差异具有统计学意义(t=9.520,P<0.01,n=6,见图8)。上述结果表明:沉默SENP1可以促进SW480细胞周期停滞。

图8 流式细胞术检测沉默SENP1对细胞周期的影响 (n=6)Figure 8 Effect of SENP1 silencing on cell cycle by flow cytometry (n=6)

2.9 沉默SENP1对SW480细胞SENP1和CCNE1蛋白表达的影响

与sh-NC组相比,sh-SENP1组SENP1(t=19.138,P<0.01)和CCNE1(t=19.282,P<0.01)的表达均降低(见图9)。

与sh-NC组相比,*P<0.05图9 Western blot检测沉默SENP1对SENP1和CCNE1蛋白表达的影响 (n=3)Figure 9 Effect of SENP1 silencing on SENP1 and CCNE1 protein expression by Western blot (n=3)

2.10 SENP1通过调控CCNE1对结肠癌的影响

裸鼠成瘤实验结果发现,沉默SENP1会抑制动物模型中结肠癌生长(见图10)。

图10 沉默SENP1后对动物模型中结肠癌生长的影响Figure 10 Effect of SENP1 silencing on the growth of colon cancer in mouse model

3 讨论

结肠癌是最常见的发生于结肠部位的恶性肿瘤,好发于直肠与乙状结肠交界处,通常40～50岁年龄组发病率最高,结肠癌已经严重影响人们的生活质量。探究其发生发展相关机制,具有重要意义。已有研究[12,13]报道SENP1在结肠癌组织中过表达,在结肠癌的发生、发展和转移中起重要作用,或为治疗结肠癌的潜在治疗靶点[11,12]。SENP1/2/3/5/6/7通过催化SUMO从其底物蛋白解偶联来逆转SUMO化[14]。其中SENP1是研究最多的同种型,研究显示其与许多癌症(如前列腺癌和结肠癌)密切相关,但其在结肠癌中的作用机制尚未见研究。SENP1是一种重要的蛋白质,可调节SUMOylation和deSUMOylation之间的平衡。有文献报道[15],SENP1在套细胞淋巴瘤患者样本和细胞系中上调。敲低SENP1可以抑制套细胞淋巴瘤细胞的增殖并促进其凋亡[14]。说明SENP1是多种癌症治疗靶点,肿瘤发生和肿瘤转移过程中起到至关重要的作用,因此本研究主要探究SENP1对CCNE1调控的结肠癌的发生发展所起的作用。本研究通过沉默SENP1,发现结肠癌细胞增殖能力和侵袭能力显著降低,且能够显著抑制动物模型中结肠癌生长,进一步研究发现沉默SENP1可有效抑制CCNE1蛋白的表达,故猜测SENP1在结肠癌中的作用或与CCNE1相关。

CCNE1是众所周知的癌症治疗靶点,在肿瘤发生和肿瘤转移过程中直接调节癌细胞的凋亡和有丝分裂[16,17]。相关学者发现METTL3在结肠癌组织中上调并与较差的存活率相关。它通过甲基化CCNE1 mRNA 3′-非翻译区(UTR)中的m6A位点来靶向细胞周期蛋白E1,从而促进结直肠癌细胞增殖[18]。本研究发现,沉默SENP1后,CCNE1蛋白及mRNA表达显著降低。说明SENP1或是通过促进CCNE1蛋白及mRNA的表达,最终促进结肠癌细胞增殖和侵袭。

综上所述,该研究显示SENP1和CCNE1在结肠癌中均高表达,通过体内体外实验得出,抑制SENP1的表达可抑制结肠癌细胞增殖、侵袭及体内成瘤能力。并且初步验证了SENP1对结肠癌细胞的作用或是通过其下游的CCNE1蛋白实现的,但其具体的作用机制仍需进一步的研究。