苦荞芽苗菜黄酮超声提取工艺

张恩华，王 亚，聂子涵，马挺军

(北京农学院 食品科学与工程学院，北京102206)

苦荞(Fagopyrumtataricum(L.) Gaertn.)别名菠麦、乌麦、花荞等，一年生草本植物。苦荞是中国主要的杂粮作物之一，生长在高寒、贫瘠等地带，主要分布在云南、贵州、四川、山西、甘肃、内蒙等地，在农业生产中占有重要地位。中国苦荞种植面积达70万公顷，产量多年居世界第一位。苦荞中含有多种营养物质，包括淀粉、蛋白质、膳食纤维、维生素、微量元素等[1,2]。苦荞还含有黄酮、酚类、多肽、糖醇、甾体等生物活性物质[3,4]，尤其是芦丁等黄酮类物质的含量高，这赋予了苦荞更高的经济价值[5]。研究表明，长期食用苦荞粉及苦荞制品，有利于降低机体血糖、血脂水平[6]。

苦荞口感较粗糙，含有蛋白酶抑制剂等抗营养因子，食用过多时易导致消化不良，这在一定程度上制约了苦荞的消费。芽苗菜是各种谷类、豆类、树类的种子经过发芽培养出来的可食用“芽菜”。芽苗菜的培育过程无需复杂操作，且培育时间较短，一般7～15 d即可成熟。利用苦荞籽粒培育的苦荞芽苗菜是一种绿色、营养的食品，具有高活性物质、高膳食纤维、低糖等特点[7]。

黄酮类物质的提取方法主要有超临界流体提取法、超声波提取法、微波提取法等。超声波提取法是将超声波作为介质，在短时间内增大物质分子运动速率，使溶剂的穿透力增强，可提升待提取物的溶出速度，且具有操作简便、时间短、试剂使用量少等优点[8]。张国涛等[9]研究了荞麦粉中黄酮类物质的超声提取方法。宋越冬等[10]发现超声提取的荞麦叶黄酮含量较高，且具有良好的抗氧化活性。

目前，有关苦荞芽苗菜黄酮提取工艺的研究报道较少。为了促进苦荞芽苗菜中黄酮物质的开发利用，本研究以苦荞麦芽苗菜为研究对象，采用超声辅助提取法提取黄酮，在单因素试验基础上，对超声时间、乙醇体积分数及液料比进行响应面优化，以期得到苦荞芽苗菜黄酮的最佳提取条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿山谷苦荞二号及芽苗培养盘，北京绿山谷芽菜有限责任公司；芦丁标准品(纯度≥99.0%)，美国Sigma公司；次氯酸钠：国药集团化学试剂有限公司；三氯化铝、乙酸钾、甲醇，北京化工厂，均为分析纯。

电子分析天平，天津德安特传感技术有限公司；超声波清洗器，宁波新芝生物科技有限公司；台式低速离心机，长沙易达仪器有限公司；恒温恒湿培养箱，湖北黄石恒丰医疗器械有限公司；紫外-可见分光光度计，上海精科仪器有限公司；高速粉碎机，潍坊德尔粉体设备技术有限公司；真空冷冻干燥机，德国CHRIST冻干机有限公司；电热恒温鼓风干燥箱，天津市中环试验电炉有限公司；立体高压蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械场；大气等离子体放电设备，实验室定制。

1.2 方 法

1.2.1 原料处理 选取籽粒饱满、无霉变、大小均一的苦荞种子，用蒸馏水淘洗干净，然后用65 ℃热水激活种子。种子经浸泡4 h后捞出，NaClO溶液消毒，用浸过水的透气软布包裹放在阴暗处进行催芽。把催好芽的种子均匀的码放在芽苗培养盘中，并在苦荞种子上盖一张经等离子活化水喷湿的纸张，然后把苦荞种子放置于背阴处进行催芽生长，培养得到苦荞芽苗菜。将芽苗菜放入冻干机中冷冻24 h至干，磨粉，放入干燥皿中备用。

1.2.2 苦荞芽苗菜中黄酮提取工艺 准确称取0.500 g苦荞芽苗粉，按照单因素乙醇浓度、液料比、超声时间、超声温度及响应面试验设计(表1，利用软件 Design-Expert.V12.0.3.0中Box-Behnken方法)的条件提取黄酮，提取结束后，使用离心机在4 000 r/min 转速下离心10 min。取上清液，得到黄酮粗提液，备用。

表1 单因素试验条件和响应面因素及水平Tab.1 Single-factor test conditions and response surface factors and levels

1.2.3 黄酮含量测定 绘制标准曲线方程Y= 0.563X-0.067 6(R2=0.999 7)，其中X为苦荞芽苗粉质量(mg)，Y为吸光度值。总黄酮的测定：取0.5 mL提取液于20 mL具塞试管中，加入0.1 mol/L三氯化铝2 mL、1 mol/L乙酸钾3 mL，再加入70%甲醇定容到10 mL刻度线，摇匀，静置30 min后于420 nm处测定吸光度[11]。重复3次，计算平均值。

式中，Y1为总黄酮含量(mg/g)；X1为提取液中总黄酮质量(mg)；m为萌发苦荞粉质量(g)；V取为提取液中移取体积；V定为提取液总体积。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声时间对黄酮得率的影响 由图1可知，当超声时间从10 min延长到20 min时，黄酮得率显著提高(P<0.05)，而当超声时间继续增加时，黄酮得率开始逐步下降。原因可能是当超声时间小于10 min，苦荞芽苗菜中的黄酮尚未提取完全；当超声时间大于10 min之后，超声处理使细胞壁破碎较完全，导致得率增加，但当超声时间超过30 min，黄酮的分子结构被破坏，杂质析出，使黄酮得率下降[12]。

图1 各因素对提取苦荞芽苗菜黄酮得率的影响Fig.1 Effect of various factors on the yield of flavonoids from Tartary buckwheat sprouts

2.1.2 超声温度对黄酮得率的影响 由图1可知，当超声温度从20 ℃上升到30 ℃时，黄酮得率显著增加(P<0.05)。而当超声温度继续增加至50 ℃时，黄酮得率逐渐降低(P>0.05)；超声温度增加至60 ℃时，黄酮得率显著下降(P<0.05)。推测可能是因为超声温度高于50 ℃时，黄酮结构易被破坏，并且会使杂质加速溶出，从而降低黄酮得率[13]。

2.1.3 乙醇体积分数对黄酮得率的影响 黄酮类物质一般易溶于水、乙醇、甲醇等极性强的溶剂[14]；但难溶于或不溶于苯、氯仿等有机溶剂。乙醇具有毒性小、回收率高的优点，所以本试验选用乙醇作为溶剂提取黄酮。由图1可知，在乙醇体积分数80%时，黄酮得率达到最大值，为28.63%。乙醇体积分数增加至90%时，黄酮得率显著下降(P<0.05)。这可能是因为乙醇浓度影响了细胞内外的浓度差，浓度越大越有利于黄酮浸出，但当乙醇浓度过高，会使苦荞芽苗菜细胞中的脂溶性物质浸出，影响了黄酮浸出速度[15]。

2.1.4 液料比对黄酮得率的影响 由图1可知，液料比在40 mL/g～80 mL/g内，随液料比增大，黄酮得率显著(P<0.05)增大，80 mL/g时达到最大值，为31.01%。当液料比增加至90 mL/g，黄酮得率下降(P>0.05)。溶液体积过小时，苦荞芽苗粉与溶液接触不充分，黄酮未被有效溶出，所以在一定的范围内，随着溶液体积变大，黄酮得率增加；但当溶液体积过高，单位体积物料接收到的超声能量降低，使黄酮溶出速率降低，得率减小[16]。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验和显著性检验结果 响应面试验结果见表2。

表2 响应面试验结果Tab.2 Response surface experiment results

利用Design-Expert.V12.0.3.0软件得到各个因素与黄酮得率间的二次回归方程：

黄酮得率=34.08-0.13A-0.10B+3.88C+0.083AB+0.36AC+0.97BC-2.00A2-0.88B2-7.55C2。

表3 回归方程系数显著性检验结果Tab.3 Results of significant test for regression coefficient

黄酮得率=34.08+3.88C+0.36AC+0.97BC-2.00A2-0.88B2-7.55C2。

2.2.2 响应面分析 利用软件绘制各因素交互作用的响应面三维曲面图和等高图。能直观反应各试验因素的交互作用情况，响应面越平缓，表明该因素对黄酮得率影响越小，响应面越陡峭，说明该因素对黄酮得率影响越大[17,18]。超声时间和液料比的响应面以及乙醇体积分数和液料比的响应面都较陡峭，但乙醇体积分数和超声时间的响应面比较平缓，可以看出乙醇体积分数对黄酮得率的影响相对较小，而超声时间和液料比对黄酮得率的影响显著。黄酮得率对应各因素构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，能客观反映各因素的交互作用及其对响应面的影响[19]。

2.2.3 最优苦荞芽苗菜黄酮超声提取工艺 通过响应面试验，得出苦荞芽苗菜黄酮的最佳超声提取工艺条件为：超声时间19.94 min、乙醇体积分数80.83 %、液料比82.63∶1，在此条件下预测的黄酮得率为34.59%。考虑到实际操作，将原有的模型条件修改为：超声时间20 min、乙醇体积分数80%、液料比80∶1，在此条件下重复3次，黄酮得率为34.24%，与模型预测值基本相符。

3 结 论

本研究通过单因素试验考察了影响苦荞芽苗菜黄酮超声提取得率的4个因素，并利用响应面试验进一步分析了超声时间、乙醇体积分数和液料比对黄酮得率的影响。初步明确了影响苦荞芽苗菜黄酮得率的因素从大到小依次为液料比、超声时间和乙醇体积分数。优化后的最佳提取工艺为超声时间20 min、乙醇体积分数80%、液料比80∶1，在此条件下的黄酮得率为34.24%。