观赏海棠‘王族’miR156a的克隆及功能验证

刘嘉伟，王杏随，潘云雪，侯颖慧，张 杰

(农业应用新技术北京市重点实验室/植物生产国家级实验教学示范中心/北京农学院 植物科学技术学院，北京102206)

观赏海棠(Ornamental Crabapple)是苹果属著名的花果共赏材料[1]。包括新叶有色品种和常色紫红色叶品种，其中红色叶片‘王族’(Malus‘Royalty’)是常色有色类品种的典型代表[2]。其花色鲜艳、果实胎红、冬果宿存，兼具抗病、耐旱、生长快等优点[3]。

花色苷作为花青素和各种糖形成的一种糖苷物质，在细胞质内合成后转运到液泡中积累[4]，然后稳定存在于植物器官中，由此产生由红到紫的颜色。众多研究表明，颜色差异与花色苷的含量密切相关[5]花色苷的合成不仅增加了植物的观赏价值，还提高植物抗氧化、消炎抑菌的生物活性，其合成代谢一直以来都是研究热点。

MicroRNAs (miRNAs) 是小的非编码内源性RNA ( 18～24个核苷酸)，参与多种生理代谢过程，如：激素信号转导与代谢产物的生物合成，以及植物的生长发育和一些胁迫应答等[6]。已有研究表明miRNA是介导植物花青素生物合成的重要调节因子[7]。miR858可以靶向拟南芥花青素合成负调节基因MYBL2参与拟南芥花青素的合成积累[8]。在低磷条件下，miR399参与miR156调控的花青素积累和根际酸化过程，miR156 和miR399 协同参与磷平衡过程[9]。对于高度保守miR156正确的时空积累维持了植物的正常发育。研究表明，miR156及其靶基因SPL家族在植物的发育过程、合成代谢及非生物胁迫中起到重要作用，是植物生长发育的调节枢纽[10]。在杨树中，miR156过表达导致花青素在茎、叶缘及叶柄表皮中大量积累。花色苷相关基因(LDOX，UFGT，GST)的转录本丰富度明显增加，有助于调控杨树中花色苷的生物合成[11]。在桃和梨中，miR156/SPL介导的两种机制可调控花色苷生物合成：血肉桃中的PpSPL1通过抑制反式启动活性PpMYB10.1(花色苷积聚的正调节剂)的表达[12]。 文中所采用的试验材料是观赏海棠 ‘王族’，首先进行克隆miR156a的前体基因，接下来把表达载体转进‘王族’ 植株中。然后进行检测花色苷含量并分析花色苷代谢途径上的相关基因的表达量，以此揭示miR156a在花色苷代谢途径中的作用。

1 植物材料及方法

1.1 植物材料

植物材料观赏海棠‘王族’在2021年3月中旬取自北京农学院海棠资源圃和组培中心培育的‘王族’植株。进行分装标记所收集的材料，用液氮迅速存样，并保存于-80 ℃。侵染试验所需材料选自观赏海棠‘王族’植株。在MS培养基中进行植株的培养(4.43 g/L MS粉末，30 g/L蔗糖，7.0 g/L琼脂，1 mg/L 6-BA，0.1 mg/L NAA，pH=5.8)。适宜的培养条件为：相对湿度70%～80%，温度24 ℃±2 ℃，光照的强度1 700～2 000 lx，光照的时间16 h光/8 h暗。

1.2 试验方法

1.2.1 提取植物总RNA 及反转录 cDNA 提取‘王族’叶片的总RNA，使用RA53-EASYspin Plus多糖多酚复杂植物RNA快速提取试剂盒(爱博森)，操作参照说明书进行。琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否污染，核酸仪检测RNA的纯度及浓度。并采用RT-PCR试剂盒(全式金)进行反转录。

1.2.2miR156a基因克隆 首先用GDR查找‘金冠’的pre-miR156a基因的序列，其在15号染色体上。取大约260 bp的基因序列，在其前体序列的上游和下游位置，结合前体序列组成新序列。引物通过Primer5进行设计。以‘王族’植株叶片反转录的cDNA作为模板，PCR反应体系cDNA,2xPhanta Max Master Mix (Dye Plus),上游引物F,下游引物R,ddH2O分别为1 μL,25 μL,2 μL,2 μL,20 μL总量共50 μL。

PCR的反应条件为: 95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s，72 ℃延伸5 min，共进行34个循环。

检测PCR产物，将目的基因片段条带进行胶回收。然后将胶回收产物与pEASY-Blunt载体进行连接，并转化 Trans-T1大肠感受态并涂板进行抗性筛选，挑选单菌落生长后，进行菌液PCR鉴定，然后送测序验证。

1.2.3miR156a前体表达载体的克隆 用限制性内切酶Xba I酶切，将克隆得到的miR156a前体序列分别构建到PDONR221表达和沉默载体上。反应体系如下：目的基因片段、载体片段、T4 DNA连接酶、2×T4DNA ligase Buffer 分别是3 μL,3 μL,1 μL,1 μL,加ddH2O至10 μL。

将以上体系产物，加入干净离心管中，慢慢混匀后放置于16 ℃的金属浴中，进行3～4 h连接后，将得到的产物转化大肠杆菌感受态，并涂板进行卡那霉素抗性筛选，挑取单菌落生长后进行PCR鉴定，然后进行测序验证。并按1∶1比例将50%甘油与测序正确的菌液进行混匀，保存于-80 ℃备用。

1.2.4miR156a的瞬时转化 首先吸取2 μL质粒加入50 μL提前融化的农杆菌感受态(GV3101)细胞里。并涂板培养，然后挑选单菌落生长后进行PCR扩增筛选阳性克隆。将鉴定正确的菌液在28 ℃条件下、200 r/min振荡过夜培养。室温下，5 000 r/min离心8 min,收集菌体，与侵染液进行重悬( 10 mmol/L MES+10 mmol/L MgCl2+200 μmol/L AS)。将菌液再次悬浮至OD600=0.8。将培养30 d左右且生长健壮，长势相同的‘王族’组培苗，将侵染菌液利用真空泵抽吸的方式转化整株组培苗，用干净滤纸吸干植株表面的液体，立刻接种到固体MS培养基(含有Cef 300 mg/L和Kana50 mg/L)中，在组培室进行培养7～10 d，期间注意观察表型。

1.2.5 实时荧光定量PCR 参照 SYBR ® Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus)酶进行，采用qRT-PCR两步法，体系参照说明书。反应条件为：预变性、变性、退火、延伸的温度分别是95 ℃，94 ℃，60 ℃，72 ℃，时间分别是3 min，20 s，30 s，30 s，cycles 39。测定关于花色苷途径相关结构基因表达量。表1为所用的荧光引物序列。待测样品的数据均进行3次生物学重复。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 花色苷含量的测定 取存样后的‘王族’叶片，用液氮迅速研磨成粉末，称量0.11 g样品，步骤参照植物花色苷含量测定试剂盒(索宝莱)说明书进行操作。后续用分光光度计，通过测定提取液在530 nm和700 nm 处的吸光度值计算样本中花色苷的含量。

2 结果与分析

2.1 miR156a前体的克隆和表达载体的构建

以‘王族’叶片cDNA为模板，进行PCR扩增得到长度为489 bp的miR156a前体序列。以miR156a前体序列为模板，在上下游引物前端加酶切位点Xba I的序列，利用T4连接酶连接过表达载体和沉默载体上，通过对载体序列的判定，获得了miR156a过表达载体(OE-miR156a)和miR156a沉默载体(Si-miR156a)。测序结果为图1所示。

图1 比对McmiR156a的表达载体序列Fig.1 Alignment of the expression vector sequence of McmiR156a

2.2 miR156a的瞬时遗传转化

通过农杆菌转化法，将miR156a的表达载体转入‘王族’植株中，放于组培中心进行培养7～10 d，利用体式荧光显微镜观察表型。与对照相比，OE-miR156a‘王族’叶片呈绿色表型，Si-miR156a‘王族’叶片呈红色表型，如图2所示。

图2 瞬时转基因‘王族’叶片表型Fig.2 Phenotype of transient genetically Malus ‘Royalty’ leaves

2.3 miR156a的相关表达量的分析

通过荧光检测瞬时转化叶片，并对转基因植株中叶片的花色苷含量进行测定，结果发现花色苷含量在过表达植株叶片中明显低于对照组，并且在沉默植株叶片中花色苷含量明显高于对照组。并在转基因植株中分析CHS、UFGT、DFR基因的表达量。由图3所示，OE-miR156a的花色苷合成相关基因的表达量呈下降趋势，Si-miR156a的花色苷合成相关基因的表达量呈升高趋势。结果表明miR156a参与负调控观赏海棠叶片中花色苷生物合成。

图3 花色苷的含量及相关基因的表达量Fig.3 Anthocyanin content and relative expression of some related genes

3 讨 论

观赏海棠是具有综合观赏价值的品种[13]。受花色苷积累的影响，叶片色泽是观赏植物的重要特征之一。花色苷广泛分布于植物各部位，抗氧化活性使其具有抗炎、保护心脑血管和抗代谢性疾病等作用[14]。它还可以吸引传粉昆虫、保护植物花粉活性、提高授粉成功率。因此研究花色苷的调控机制以及相关色素的合成代谢有重要意义[15]。

miRNA不仅在转录水平上调节基因的表达，而且在调控植物生长、形态发育等各方面均起重要作用。目前对miRNA的功能研究主要通过miRNA过表达、miRNA基因缺失突变体和靶标模拟技术手段[16]。miR156是植物中保守的一类miRNA，其靶基因SPL为编码含有SBP-BOX结构域的转录因子，在植物中的重要调节作用已成为近年来研究的热点。拟南芥miR156家族有8个成员(miR156a-h)，其中miR156a与miR156c在控制幼年营养生长期向成年营养生长期转变过程中起主要作用[9]。

本研究主要通过对观赏海棠‘王族’中的miR156a前体进行克隆，得到489 bp的miR156a前体序列，并构建表达载体侵染‘王族’组培苗。测定了转基因‘王族’组培苗的花色苷含量及相关结构基因CHS、DFR、UFGT的表达量，发现OE-miR156a其表达量降低，Si-miR156a其表达量升高。植物的花色苷代谢途径受多种因素影响：外界环境因素如温度、光照、水等以及环境的pH、糖类、植物激素等；自身遗传因素如植物本身产生的色素种类以及相关调控基因差异所起的作用。但是在调控花色苷的合成上，miR156a的表达是否起作用，尚未研究。该结果为进一步探究植物中miR156a对花色苷的代谢途径提供了一定的理论基础。