基于网络药理学解析复方血栓通胶囊改善微循环的作用机制*

毕聪，吴灏，王永刚，彭维，苏薇薇，刘宏

中山大学生命科学学院/广东省中药上市后质量与药效再评价工程技术研究中心，广东 广州 510275

复方血栓通胶囊由三七、黄芪、丹参、玄参四味药材组成，系广东众生药业股份有限公司独家生产的名优中成药品种，具有活血化瘀，益气养阴的功效，临床上主治血瘀兼气阴两虚证的视网膜静脉阻塞及稳定性劳累型心绞痛［1］。研究表明，视网膜静脉阻塞［2］、急性心肌梗死［3］、动脉粥样硬化［4］等疾病与微循环障碍密切相关，而复方血栓通胶囊改善微循环的作用靶点与机制尚不明晰。本文基于网络药理学技术，通过筛选微循环相关活性成分与作用靶点，构建药材-成分-靶点-通路综合网络，解析复方血栓通胶囊改善微循环障碍的作用机制。

1 实验方法

1.1 微循环障碍靶点获取

利用GeneCards（https：//old. tcmsp-e. com/tcmsp. php）和OMIM（https：//omim. org/）数据库［5］，以microcirculation 为关键词，选择“Relevance score≥4.0”的基因。同时搜索文献中与微循环障碍相关的基因，去除重复基因。

1.2 复方血栓通胶囊化学成分及作用靶点获取

利用中药系统药理数据库（TCMSP）（http：//tcmspw. com/tcmsp. php） 数据库［6］，以“三七”“黄芪”“丹参”“玄参”为关键词，选择口服生物利用度（OB，oral bioavailability）≥30%、化合物类药性（DL，drug-like）≥0.18［7］的化学成分用于下一步分析。利用TCMSP 数据库及参考文献获取各化学成分的作用靶点，并将所得靶点通过UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org/）转化为基因名称。

1.3 活性成分及改善微循环靶点筛选

采用Venny 平台（https：//bioinfogp. cnb. csic.es/tools/venny/）将微循环相关靶点与复方血栓通胶囊作用靶点取交集，作为复方血栓通胶囊改善微循环障碍潜在作用靶点。与潜在作用靶点相关联的成分作为复方血栓通胶囊的活性成分。

1.4 蛋白相互作用（PPI）网络构建及核心基因筛选

将复方血栓通胶囊微循环潜在作用靶点导入STRING（https：//string-db.org/）［8］平台，蛋白种属选择“Homo sapiens”，最低相互作用得分选择中等置信度“medium confidence（0.4）”。将“TSV”格式数据导入Cytoscape［9］，构建PPI 网络，并利用“Network Analysis”的“Generate style from statistics”功能将PPI 网络可视化。利用“cytoHubba”功能筛选核心基因。

1.5 生物功能与通路富集分析

利用DAVID 数据库（https：//david. ncifcrf. gov/）对潜在作用靶点进行GO（gene ontology）功能分析，利用Cytoscape 中“ClueGO、CluePedia”插件对潜在作用靶点进行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信号通路分析［10］，并利用GraphPad软件将结果可视化。

1.6 活性成分-改善微循环靶点-通路网络构建

将复方血栓通胶囊活性成分、改善微循环潜在作用靶点、KEGG 通路导入Cytoscape，构建活性成分-靶点-通路网络。其中，节点代表活性成分、基因或通路，连线代表生物分子的作用关系，以度值和介数作为评价节点在网络中重要性的参数。

2 结 果

2.1 改善微循环靶点及活性成分筛选

通过GeneCards、OMIM 数据库及文献检索，共获取微循环相关靶点187 个，利用TCMSP 数据库及文献检索，共获取复方血栓通胶囊作用靶点151 个。取二者靶点交集（图1），筛选得到复方血栓通胶囊改善微循环的潜在作用靶点40 个（表1）、关联活性成分41 个（表2）。其中，归属三七的活性成分有7个，为人参皂苷Rg1、三七皂苷R1、三七素等皂苷类成分；归属丹参的有20 个，为丹参酮ⅡA、隐丹参酮等丹参酮类成分和迷迭香酸、丹酚酸B、原紫草酸等酚酸类成分；归属黄芪的有8 个，为芒柄花素、毛蕊异黄酮等黄酮类成分和黄芪甲苷等皂苷类成分；归属玄参的成分有6个，为哈巴俄苷等环烯醚萜类成分和安格洛苷C等苯丙素苷类成分。

图1 复方血栓通胶囊作用靶点与微循环靶点交集韦恩图Fig.1 The Venn diagram of targets of CXC and microcirculation

表1 复方血栓通胶囊改善微循环潜在作用靶点Table 1 The potential targets of CXC to improve microcirculation

表2 复方血栓通胶囊改善微循环活性成分Table 2 The active compounds of CXC to improve microcirculation

2.2 蛋白互作网络构建（PPI）及核心基因筛选

利用STRING数据库、Cytoscape，构建40个复方血栓通胶囊微循环潜在作用靶点的PPI 网络图（图2），筛选出核心基因（图3）为IL6、CCL2、ICAM1、EDN1、JUN、NOS3、PTGS2、VCAM1、MMP9、TNF。结果提示这些靶点可能在复方血栓通胶囊改善微循环障碍的作用中发挥核心作用。

图2 复方血栓通胶囊改善微循环潜在作用靶点互作网络图Fig.2 The protein-protein interaction network of CXC to improve microcirculation

图3 靶点互作网络中的核心基因Fig.3 The hub genes in the protein-protein interaction network

2.3 GO功能富集分析

分别以生物过程（BP，biological process）、细胞组分（CC，cellular components）和分子功能（MF，molecular function）对复方血栓通胶囊微循环潜在作用靶点进行功能富集分析，列出显著性最高的10条（图4～6）。结果表明，在生物过程方面，主要富集于inflammatory response、lipopolysaccharidemediated signaling pathway、response to hypoxia 等，涉及炎症反应、脂多糖信号通路、白细胞迁移、缺氧反应等；在细胞组分方面，主要富集于extracellular space、external side of plasma membrane、blood microparticle 等，涉及细胞外间隙、质膜外层、细胞外基质、细胞连接、血液微粒等，可能主要通过作用于细胞表面或细胞间物质发挥作用；在分子功能方面，富集于serine-type endopeptidase activity、heme binding、transmembrane signaling receptor activity 等方面，涉及丝氨酸型内肽酶活性、血红素结合、跨膜受体活性、一氧化氮合酶活性等。

图4 复方血栓通微循环潜在作用靶点的生物过程富集分析Fig.4 Biological process analysis of potential targets of CXC to improve microcirculation

图5 复方血栓通微循环潜在作用靶点的细胞组分富集分析Fig.5 Cellular components analysis of potential targets of CXC to improve microcirculation

图6 复方血栓通微循环潜在作用靶点的分子功能富集分析Fig.6 Molecular function analysis of potential targets of CXC to improve microcirculation

2.4 KEGG通路富集分析

对复方血栓通胶囊微循环潜在作用靶点进行KEGG 通路分析，共富集到了107 条通路，筛选富集靶点数排名前20 的通路（图7）。结果表明，复方血栓通胶囊可作用于血管相关通路Fluid shear stress and atherosclerosis（血流剪切应力及动脉粥样硬化）、HIF-1 signaling pathway（缺氧诱导因子1 信号通路）、Relaxin signaling pathway（松弛素信号通路），通过调节血液流变、扩张血管、促进血管生成、增加微循环血流灌注等改善微循环障碍；也可作用于免疫炎症相关通路，如Complement and coagulation cascades（补体与凝血级联反应）、TNF signaling pathway（肿瘤坏死因子信号通路）、IL-17 signaling pathway （白细胞介素17 信号通路）；作用于神经活性相关通路Neuroactive ligandreceptor interaction（神经活性配体-受体相互作用）以及糖尿病相关通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）。由此可见，复方血栓通胶囊改善微循环障碍，可能通过调节血液流变、扩张血管、促进血管生成、增加微循环血流灌注、调节炎症免疫、神经活性等方面的靶点及通路而实现。

图7 复方血栓通胶囊微循环潜在作用靶点的KEGG通路结果图Fig.7 The KEGG pathways of potential targets of CXC to improve microcirculation

2.5 活性成分-靶点-通路网络构建

将41 个活性成分、40 个作用靶基因、富集靶点数排名前10 的KEGG 通路导入Cytoscape，构建复方血栓通胶囊改善微循环的活性成分-靶点-通路网络图（图8）。其中紫色菱形代表靶点，灰色三角为通路，圆形为活性成分（绿色为三七成分，黄色为丹参成分，蓝色为黄芪成分，粉色为玄参成分）。

图8 复方血栓通微循环相关活性成分-靶点-通路网络图Fig.8 The active compound-target-pathway network of CXC to improve microcirculation

3 小结与讨论

微循环即微动脉和微静脉之间的血液循环，是机体进行血液和组织间物质交换的场所。当机体受到某些病理因素的刺激时，出现血管炎症和内皮功能异常，引起血液流速减慢或形成血栓，进而引发微循环障碍［11］。临床数据表明，微循环障碍是造成糖尿病［12］、胰腺炎［13］、脑损伤［14］、脓毒症［15］、心血管［16］等多种疾病的重要原因。已有研究表明，复方血栓通胶囊可显著增加血流灌注量，扩张血管，从而改善视网膜、心肌组织的微循环障碍［1，17-18］。

本研究基于网络药理学，筛选出复方血栓通胶囊与改善微循环相关的41 个活性成分，主要为人参皂苷Rg1、三七皂苷R1等皂苷类成分，芒柄花素、毛蕊异黄酮等黄酮类成分，丹参酮ⅡA、隐丹参酮等丹参酮类成分，迷迭香酸、丹酚酸B等酚酸类成分，哈巴俄苷等环烯醚萜类成分，以及安格洛苷C等苯丙素苷类成分。筛选出复方血栓通胶囊与改善微循环相关的40 个潜在作用靶点，其中IL6、CCL2、ICAM1、EDN1、JUN、NOS3、PTGS2、VCAM1、MMP9、TNF发挥了关键作用。

复方血栓通胶囊微循环潜在作用靶点富集于心血管、免疫炎症、神经活性及糖尿病相关通路。在心血管通路方面，HIF-1信号通路对微循环的建立有重要意义［19］，复方血栓通胶囊可直接调控HIF 信号通路中的核心基因HIF-1α（图9），进而影响红细胞生成、血管形成、铁代谢、血管舒张等；也可调控下游血管内皮生长因子（VEGF）、纤溶酶原激活剂抑制剂-1（PAI-1），直接影响血管形成；以及调控内皮素（EDN-1）、一氧化氮合酶（iNOS、eNOS），调节血管舒张、血小板聚集以及血管平滑肌增生［20］。在炎症方面，微循环内皮细胞被激活后，细胞间黏附因子-1（ICAM-1）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和趋化因子等被大量释放，引起白细胞聚集，同时影响血管通透性，形成微血管血栓［21］。复方血栓通胶囊可调控TNF 信号通路等炎症相关通路（图10），通过调控TNF-α、IL6、CCL2、MMP9、ICAM-1、VCAM-1、E-选择素等，调控炎症因子的释放、白细胞黏附、血管重构、细胞黏附等。在神经活性方面，交感神经通过支配微血管的平滑肌，调节血管收缩舒张及微循环的血流量［22-23］。复方血栓通胶囊可通过调节乙酰胆碱受体2（CHRM2）、肾上腺素能受体（ADRB2）、糖皮质激素受体（NR3C1）、补体（C3、C5）等调控Neuroactive ligand-receptor interaction信号通路，从而影响微循环血流量。

图9 推测的复方血栓通胶囊在HIF-1信号通路的作用Fig.9 The effect of CXC in HIF-1 signaling pathway

图10 推测的复方血栓通胶囊对TNF信号通路的作用Fig.10 The effect of CXC in TNF signaling pathway

综上所述，本研究揭示了复方血栓通胶囊可能通过调控心血管、炎症免疫、神经活性等相关靶点与通路，影响血管形成、血管舒张、血管平滑肌增生及微循环血流量，发挥改善微循环作用；为其机制解析、临床用药提供了依据。