禽腺病毒4型的研究现状

薛晓岩，张振兴，季 佳，王雯慧,3，代红炀，李高银，李素华*，宋建领*

(1.西南林业大学生命科学学院，云南昆明 650224；2.云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南昆明 650224；3.中国医学科学院医学生物学研究所，云南昆明 650031；4.会泽黑颈鹤国家级自然保护区管护局，云南曲靖 654200；5.昭阳区动物卫生监督所，云南昭通 657000)

禽腺病毒4型(Fowl adenovirus 4，AdV-4)是近年来在我国暴发的以禽心包积液和肝炎为主要特征的病毒性传染病，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。该病起源于巴基斯坦安卡拉地区，又称“安卡拉病毒”，之后在伊拉克、印度、智利、美国南部和中部、韩国、波兰、日本等国家和地区大面积暴发和流行。2014年我国北方多地相继暴发该病，2015年开始在我国呈地区流行态势。近年来，该病的诊断技术、疫苗研制和防控技术的研究都取得了一定的进展，为了更好地预防和控制该病的发生与流行，本文比较全面的综述了该病的病原学特点及其研究成果。

1 禽腺病毒的病原学

1.1 禽腺病毒分类

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)是属于禽腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒属的是一种DNA病毒。根据病毒群特异性抗原的差异性，可将FAdV分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3个亚群。禽腺病毒Ⅰ群(FAdV-Ⅰ)具有共同的群抗原，是鸡胚致死孤儿病(chicken embryo lethal orphan，CELO)和鸡包涵体肝炎(inclusion-body hepatitis，IBH)的主要病原；禽腺病毒Ⅱ群(FAdV-Ⅱ)是雏鸡大理石脾病(Marble spleen disease，MSD)的主要病原；禽腺病毒Ⅲ群(FAdV-Ⅲ)是引起减蛋综合征(Egg drop syndrome，EDV)的代表性毒株。

FAdV Ⅰ群与Ⅱ群无抗原相关性，二者与Ⅲ群只有部分抗原交叉反应[1]。根据抗血清的交叉中和反应特性和限制性内切酶片段长度多态性技术分析,可将Ⅰ亚群FAdV分为12个血清型(1～8a，8b～11)和5个基因型(A～E)。血清型和基因型具有确定相关性，其中A基因型包括1个血清型(FAdV-A-1)，B基因型包括1个血清型(FAdV-B-5),C基因型包括2个血清型(FAdV-C-4和FAdV-C-10),D基因型包括4个血清型(FAdV-D-2、FAdV-D-3、FAdV-D-9和FAdV-D-11),E基因型包括4个血清型(FAdV-E-6、FAdV-E-7、FAdV-E-8a和FAdV-E-8b)。当前国内主要流行C和E两种基因型，FAdV-11、FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b，FAdV-D-11等血清型均在国内感染鸡中分离到，尤其以FAdV-C-4流行范围最广、致病性最高，在家禽养殖中危害最大[2，3]。

1.2 禽腺病毒结构及主要结构蛋白

FAdV是20面体对称的球形状，无囊膜包被，直径为70 nm～90 nm[4]，病毒外壳由衣壳蛋白(Capsid)、核酸芯髓(Core)和纤突(Fiber)及相关蛋白组成，病毒结构如图所示(图1)[5]。其中衣壳蛋白由240个六邻体(Hexon)、12个五邻体(Penton)和12个纤突(Fiber)3种结构蛋白构成[6]。病毒核酸为双链DNA结构，包裹在蛋白质外壳中心部位，占整个病毒体积的11%～14%，因此FAdV也被认为是目前体积最大和结构最复杂的DNA病毒。基因组约为43 kb～46 kb，基因两端各含有一个约40 bp～200 bp末端重复序列[7]。

图1 禽腺病毒粒子模式图[5]Fig.1 Pattern diagram of avian adenovirus particles[5]

1.2.1 六邻体蛋白 六邻体(Hexon)蛋白基因全长2 829 bp，共编码943个氨基酸，是结构蛋白中含量最高、分子量最大、结构最稳定的蛋白，且FAdV各亚群的Hexon具有较高同源性。Hexon是由3条长度相近的六邻体多肽链(330 ku～360 ku)聚合而成的非顶点壳粒子。每个六邻体多肽由基底区(pedestal regions)和高变环区(variable loops)两部分构成，基底区包括P1、P2两个保守区域，高变环区由Loop 1～4共4个环装区共同构成，其中Loop 1区由132-289位aa组成，Loop 2区由363-507位aa组成，Loop 4区在793-878位aa组成[8，9]。Hexon蛋白具有特异抗原决定簇，可通过loop 1区遗传进化分析确定FAdV血清型[10]。FAdV的毒力也可能由Hexon介导，高致病性FAdV-4毒株的Hexon蛋白被非致病性毒株Hexon替换后，毒力明显减弱[11]。此外，Hexon蛋白的高变环区与病毒感染力密切相关，研究表明在FAdV复制前期，高变环区与宿主肺巨噬细胞scavenger受体SR-A6的结合，可促进病毒入侵宿主细胞，并加快复制过程[12]。

1.2.2 五邻体蛋白 五邻体(Penton)蛋白由5个多肽组成顶点壳粒，壳粒直径8 nm～10 nm，均排在三角形面上。Penton可与Hexon蛋白结合介导病毒与宿主细胞黏附，并通过与宿主细胞受体结合，激活宿主细胞发生病变[13]。

1.2.3 纤突蛋白 衣壳蛋白的12个纤突(Fiber)蛋白均以Penton base为基底，长约为9 nm～77.5 nm，以天线样穿过衣壳伸出到顶端，是病毒最外侧蛋白[14]。蛋白远端为头结区，形成球域蛋白(Knob protein)，结合有FAdV的血凝素蛋白，是病毒与宿主细胞表面受体结合的部位，直接介导病毒与靶细胞接触。通常哺乳动物腺病毒只有一种纤突蛋白，而FAdV中均存在两种长度具有差异的纤突蛋白，即长纤维Fiber-1和短纤维Fiber-2，分别由基因独立编码。虽然两种Fiber蛋白的存在是所有FAdV所共有的，不同血清型FAdV中的两种Fiber编码基因具有差异性，使得Fiber长度存在血清型差异性,其中FAdV-A-1是唯一存在50 nm极端长度差的血清型，这一特征可作为FAdV-A-1与其他血清型的鉴别标志[15]。然而有研究对FAdV代表毒株的Fiber序列深入研究后发现，FAdV-C是唯一具有相同长度的Fiber蛋白的FAdV物种[16]。研究表明，Fiber-2基因有助于增强病原体的增殖能力，缺失该基因，将无法产生病毒粒子，从而使病毒失去毒性，高致病性FAdV-4毒株的Fibe-2被弱毒株ON1 Fiber-2替换后病毒毒性明显减弱[10]。

1.3 禽腺病毒理化特性

由于FAdV无囊膜包被，因此病毒对乙醚、胰蛋白酶等脂溶剂具有较强的抵抗力，经脂溶性溶剂处理后的病毒仍具有感染性。低温环境更有利于FAdV-Ⅰ病毒粒子存活，可在-20℃环境中长期存活，但在56℃经30 min可灭活；病毒对pH环境有相当强的耐受能力，在pH 3～9中仍可保持感染性。但1 g/L的甲醛溶液和DNA抑制剂5-碘-2脱氧尿苷可使病毒迅速灭活。FAdV-Ⅰ不可凝集禽类红细胞，但在pH 6～9的室温条件下可凝集大鼠红细胞，血凝素对胰酶、RNA酶、神经氨酸酶不敏感。

2 FAdV-4流行病学特征

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)是致病性最强的腺病毒[17]，不仅能够引起鸡包涵体肝炎，还能引起心包积液，称为心包积液-包涵体肝炎综合征(Hydropericardium syndrome-inclusion body hepatitis,HPS-IBH)或者称为鸡心包积水综合征(Hydropericardium syndrome,HPS)[18]。该病最早暴发于1987年的巴基斯坦的安卡拉地区的肉鸡场内，因为较强的传染性使得在巴基斯坦其他地区迅速传播，故又称为“安卡拉病毒”。

2.1 FAdV-4的易感动物

FAdV-4易感肉鸡、蛋鸡、鸭、鹅等家禽，也可感染野生禽类。有学者[19]在野生黑鸢组织细胞切片中发现类似腺病毒的病毒颗粒。2014年有学者[20]在鸵鸟、乌鸦和鸽中成功分离到FAdV-Ⅰ，并通过阳性标准血清将分离株鉴定为FAdV-4。通过血清学试验，在麻雀、孔雀血液中检测到FAdV-4抗体呈阳性。研究者在死亡南极贼鸥的心脏、气管、肺脏、肠道、肝脏以及肾脏组织中用PCR技术成功获得FAdV基因组全长[21]。在2020年，国内研究者第一次从鹌鹑中分离到FAdV-4毒株[22]。此外，我国学者从疑似患有HPS-IBH的鸳鸯肝脏组织中分离鉴定到一个FAdV-4分离株，该毒株来自患HPS-IBH家禽传播感染[23]。

2.2 FAdV-4的传播途径

通常该病多见于高温和潮湿地区，并且与多种家禽混养地区或者大规模饲养肉鸡地区。研究表明，FAdV-4能长期潜伏于粪便、鼻气管黏膜和肾脏中，可以通过各种排泄物排毒，其中粪便中载毒量最高，因此大部分发病鸡是通过带毒粪便经粪-口途径传播。研究显示病毒可通过呼吸道排放的病毒颗粒形成气溶胶，在鸡群短距离范围内缓慢传播，但感染率较低。此外，病毒也可通过种蛋、鸡胚垂直传播。

2.3 FAdV-4的流行特征

起源于巴基斯坦安卡拉的FAdV-4，目前已在印度、中东、土耳其、斯洛伐克、墨西哥、秘鲁、厄瓜多尔、俄罗斯、孟加拉国、智利、韩国和科威特有报道[24]。2014年开始在我国多地零星散发，2015年6月在我国呈现地方流行性，在山东、河南、江苏、安徽、湖北、广东、海南、云南等地均有报道[25,26]。研究者通过对我国2015年-2016年流行的105株FAdV进行序列分析发现，其中93%为FAdV-4，说明FAdV-4是引起我国鸡HPS的主要病原[27]。通过对2015年我国分离到的12株FAdV-4的Hexon基因遗传进化分析表明，国内流行毒株可能源于印度株[28,29]。病毒分子特征分析显示2015年国内流行的FAdV-C-4和FAdV-E-8b毒株的Hexon蛋白，相比早期毒株已分别出现17个和84个核苷酸突变位点，氨基酸突变率分别为2.9%和10.4%。深入研究发现，国内不同地区的分离株可能具有共同的祖先，李昕键等[30]分离到的海南HN1605毒株与山东分离株SDSX、SDXT2-15、SDSX-15、SDNY2-15 和湖北分离株HB1510、HBLF-15均来自同一毒株。近年来，国内开始出现FAdV-4新毒株，这些毒株均分离自IBH和HPS患鸡，该毒株与以往毒株的全基因组序列相比有一个ORF19缺失，为近年来FAdV-4毒性和传染性增强提供一定的理论基础[31]。

3 FAdV-4型检测方法

3.1 病毒分离

由于肝脏是病毒载量最高的发病器官，通过将病鸡肝脏组织研磨、过滤、除菌制成悬液，接种于6～9日龄SPF鸡胚的卵黄囊、尿囊膜或尿囊腔的方式盲传3代，收集鸡胚尿囊液、尿囊膜鸡鸡胚肝组织可实现病毒的分离和纯化。有研究表明FAdV-4经卵黄囊途径接种鸡胚后在鸡胚肝脏组织中的增殖效果最好，病毒载量最高，鸡胚胎肾细胞、肝细胞、成纤维细胞中也能分离到病毒，但病毒载量较低[32]。

3.2 分子生物学技术

实验室最常用的检测FAdV-4的方法是针对Hexon和Fiber设计引物，通过PCR鉴别特定血清型。近年来荧光定量PCR及特异性LAMP也被应用于FAdV-4的鉴定。Pan等人建立了针对Hexon Loop 1区的探针荧光定量PCR检测方法，具有更高的敏感性[33]。钟鸣等人建立了FAdV-4特异性LAMP的检测方法。也有学者[34]建立了基于Fiber基因的PCR-RFLP方法，可有效鉴别毒株是否可诱导HPS。

3.3 血清学方法

血凝和血凝抑制试验常用于鉴定FAdV-4的血清型。Manzoor S等人通过使用人O型红细胞血凝抑制试验从野鸟中检测出FAdV-4的血清抗体。近年来Feichtner等人利用FAdV-1和FAdV-4的Fiber作为抗原建立了2种血清型的ELISA鉴别检测方法[35]。研究表明FAdV-4血清可以中和FAdV-11，但FAdV-11血清却不能中和FAdV-4，同时FAdV-4、FAdV-8a和FAdV-8b之间也均不能相互中和，但FAdV-11与FAdV-8b之间可以相互中和[9]。

4 FAdV-4型疫苗

在研制FAdV-4弱毒活疫苗和油乳剂灭活疫苗的同时，很多研究者在FAdV-4基因工程疫苗和亚单位疫苗研究中也获得一定进展。张丹等研制的Penton、Fiber 2亚单位疫苗免疫均可使SPF鸡获得100%的保护率，且以Penton蛋白为抗原的疫苗刺激鸡产生的抗体效价更高，抗体保护期更长[36]。范维等研制的FAdV-4 Fiber 2蛋白亚单位疫苗也能够保护鸡只免受强毒的攻击[37]。韦悠等制备了FAdV-4和FAdV-8的多价油乳剂灭活苗，结果表明该疫苗稳定性及安全性良好，免疫效果能持续6个月以上[38]。庞洪泽构建的FAdV-4 Hexon和Penton串联基因核酸疫苗，在雏鸡体内产生了特异性抗体[39]。疫苗的制备工艺也将影响免疫效果，研究表明HPS病死鸡肝匀浆油乳剂疫苗保护效果明显较铝胶佐剂的效果要好,鸡胚肝细胞匀浆(CEHH)疫苗的抗原含量较HPS-LH要低很多[40]。

5 展望

近年来，由于FAdV-4的迅速传播，对国内外家禽养殖业造成巨大的经济损失，该病的预防措施和治疗得到了国内外研究人员的高度重视。研究人员通过对FAdV-4病毒粒子的研究，一些制备的灭活疫苗和新型疫苗对阻断FAdV-4的传播有一定的效果。为了有效防控该病的发生与流行，应该加强对新出现的FAdV-4型毒株生物学特性、发病机制、诊断检测技术、该病与家禽其他传染病之间的关联性研究。家禽感染FAdV-4后诱导宿主免疫器官产生免疫逃避，应进一步探究其潜在的分子机制和参与该过程的细胞因子对阐明该病发病机制提供理论基础；在终端检测技术方面，未来应研究敏感、特异、快速的新型等温扩增、免疫酶等检测技术，能够检测不同感染宿主中不同组织样品病原核酸；在该病与家禽其他传染病之间的共感染中，应该深入研究共感染因子和宿主之间的作用机制，对家禽常见疫病与FAdV-4共感染病例之间在组织损伤、生化水平和年龄依赖等方面进行对比，有助于对研究共感染的致病机制提供依据。