肾型传染性支气管炎病毒致病机理及疫苗研究进展

李 宁，郭连营，许普之，黄 橙，陈 卫，郭小权

(江西农业大学，江西南昌 330045)

肾型传染性支气管炎病毒(Nephropathogenic infectious bronchitis virus，NIBV)属于γ冠状病毒，传染性及强，且传播速度快[1]，可损伤鸡的多个器官组织[2]。病鸡咳嗽、打喷嚏、拉白色稀便、产蛋下降等临床表现，且表现出强烈的肾脏组织嗜性，是诱发内脏痛风暴发的主要病原体之一[3]，在感染NIBV后，病死率可达5%～30%[4]。

NIBV基因组为单股正链RNA，全长约为27.6 kb，是已知RNA病毒中最大的病毒[5]。此病毒由4种编码结构蛋白和15种非结构蛋白共同调节。结构蛋白中纤突蛋白S1基因变异性最大，且S1氨基酸序列的变异性决定了IBV的宿主和组织趋向性[6]；N基因进化最慢，而E基因在所有结构蛋白编码基因中进化速度最快；M蛋白是病毒结构总蛋白含量的40%左右,近N末端有2个糖基化位点，C端无明显的亲水区或疏水区,其作用与病毒颗粒的形成相关[7]。

在过去的15年里，特别是在亚洲和中东国家，肾型IBV已成为主要的IBV类型[8]。第一个肾源性IBV毒株在美国和澳大利亚报道，后来在世界其它地区均见报道[9]。在2011年、2014年和2019年，中国分别发现DMV/1639/11、γCoV/CK/China/I0111/14和SD/04/1等肾源性毒株[10]。QX型IBV于1996年在中国首次被报道[11]，之后肾型QX毒株在中国、德国、荷兰、比利时、法国、瑞典、波兰、俄罗斯、斯洛文尼亚、西班牙和英国广泛流行[12]。新型肾型毒株有B1648毒株、KM91毒株、Morocco/38毒株、SCU-14/2013-1毒株、Eg/CLEVB-2/IBV/012毒株和QX毒株等分别在比利时、韩国、墨西哥、利比亚、埃及、中国等国家(或地区)流行[9]。

由于该病毒不仅可以通过排泄物污染进行接触性传播，也可以通过空气进行呼吸道传播；病鸡康复后35天内仍具传染性，传播速度又快，只要鸡群发病就会快速蔓延至全群；并且所有日龄的鸡不分性别和品种，均对NIBV易感；又因为NIBV基因组在日常环境中易发生变异，导致病毒的基因型、血清型、致病性、免疫原性等极易发生改变。因此，在NIBV的预防、诊断和治疗方面具有很大的挑战。

1 致病机理

在20世纪末和21世纪初，我国主要通过生化指标和组织病理切片来研究NIBV对肾脏的损伤程度。得到的结果是NIBV感染后，造成鸡肾小管上皮细胞的损害和间质中炎症细胞的浸润，从而导致肾脏功能下降，引起尿酸盐排泄障碍并在肾脏中沉积，进一步加速肾衰竭甚至坏死[13]。但随着科技的发展，我国对NIBV致病机理进行了更加深入的研究。

近几年有研究者表明NIBV感染可引起肾脏XOD基因转录水平增高和血清XOD活性的增强。也引起血清中MDA的含量升高、GSH-PX和SOD的含量降低，从而直接导致抗氧化酶的减少；抗氧化酶的减少，引起ROS与机体内的蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物结合产生更多的自由基，从而使体内抗氧化功能再次降低，进一步促进肾脏损伤、加速尿酸沉积，导致高尿酸血症[14](图1)。且在NIBV感染后，Toll样受体激活机体天然免疫NF-κB信号通路，诱导促炎因子(IL-6、IL-1β)、抗炎因子IL-10和趋化因子的表达[15-16]。

图1 NIBV感染机制图[16]Fig.1 Mechanism diagram of NIBV infection

通过免疫组化和免疫荧光定位发现病毒主要侵害肝脏组织中央静脉周围的细胞和肾脏组织的肾小管上皮细胞[17]，且肝和肾的损伤程度与NIBV感染后组织的病毒载量密切相关[2]。

通过NIBV感染实验动物后体外和体内动态监测器官组织的病毒载量，与呼吸型毒株相比，发现肾型IBV最先感染的器官是呼吸道黏膜，之后以外周血单核细胞为载体将病毒输送至各器官组织[18]，而呼吸型毒株只能在支气管内繁殖，不能以单核细胞为载体扩散病毒。

近几年大量的研究者采用多组学方法来描述NIBV致痛风鸡肾脏的代谢变化和免疫反应，结果显示[3]感染NIBV时可改变鸡肾细胞膜结构并破坏其形态，产生大量的ROS可导致脂质氧化和线粒体功能障；破坏肠黏膜的完整性、并可能减缓肠绒毛上皮细胞的生长；且16S rRNA基因测序发现NIBV感染会改变鸡回肠微生物的组成结构，引起鸡回肠微生物多样性下降[19]。而肠道功能包括营养吸收、粘膜屏障强化、异生物代谢、血管生成、免疫和炎症反应。因此肠道微生物紊乱，导致机体对外界的体抗力下降，往往继发或者并发支原体、大肠杆菌等疾病的感染，而提高鸡群的死亡率。

机体感染NIBV一段时间后免疫系统会受到很大的干扰，一方面可以激发机体的免疫反应，另一方面也会损伤免疫器官，导致免疫功能紊乱。根据法氏囊代谢组学分析，从法氏囊组织中筛选出与肾型IBV发病机制相关的75种差异代谢物，主要有缬氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、支链氨基酸等物质。这些小分子代谢物影响着糖酵解、糖异生、脂肪酸代谢、氨基酸代谢等能量代谢途径[1]。

2 实验室诊断技术

前些年我国检测NIBV的方法有血清学检测技术，包括血凝和血凝抑制试验(hemagglutination and hemagglutination inhibition test,HA&HI)、琼脂扩散试验、病毒中和试验(virus neutralization test,VN)、荧光抗体技术(fluorescent antibody technology,FA)、酶联免疫吸附试验(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)和胶体金免疫层析技术。随着科技的发展，在经典的IB诊断方法上，探索出特异性更高、敏感性更强、效率性更高、实用性更突出的分子生物学检测技术。目前分子生物学检测技术包括实时荧光定量PCR(real-time PCR)、环介导等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP)、核酸探针技术、基因芯片技术[20]。其他分子生物学技术如扣锁探针(padlock probe,PLPs)和滚环探针技术、新一代测序(next generation sequencing,NGS)技术已被证明可用于检测IBV[21]。

3 疫苗

本世纪初期，我国对NIB的防控主要采用的疫苗有弱毒苗、组织灭活苗和油乳剂苗。弱毒苗是用于控制IBV感染的第一代有效疫苗，也在家禽业中使用广泛。灭活疫苗通常是通过甲醛等灭活剂灭活后制成，IBV灭活疫苗可以单独使用或与IBV减毒活疫苗结合使用。如今我国对NIB进行预防免疫的疫苗主要有弱毒苗、灭活苗、重组活载体疫苗、基因工程苗、核酸疫苗和亚单位疫苗。

3.1 弱毒苗

弱毒苗是从病原体中分离出来的，方法是将它们连续传代到无特定病原体(specific pathogen free,SPF)的鸡胚中。前些年研究者发现弱毒苗在免疫原性和免疫保护性之间表现出良好的平衡[22]，2017年BRU等人证明了在使用包含2种不同抗原疫苗的联合计划后，提高了不同血清型IBV的防护;且在使用2种不同的减毒活疫苗时将间隔14 d比当天将疫苗联合使用可得到更广泛的交叉保护[23]。虽然使用弱毒苗通常被认为是控制该病毒感染最具效益的手段，但IBV疫苗的单一血清型不能提供足够的保护，因此，生产者给予1种以上的疫苗血清型，以增加其群体的保护广度；然而，这一策略增加了变异的风险[24]。还因RNA病毒复制的特殊性，连续传代产生的减毒疫苗株存在毒力返强或潜在重组的风险[25]。重要的是，弱疫苗对高温很敏感，因此在运输和储存时要使用冷链来保持疫苗的质量；然而，维持活疫苗质量所需的额外制冷设备和冷藏室对偏僻地区的鸡群接种疫苗的资源有限；一般来说，分配和管理成本通常大于疫苗生产成本；在发展中国家，这是广泛实施免疫接种的主要障碍之一。也有学者为了优化了弱毒苗，天然重组肾源性K40/09型IBV进行了热适应，表现出显著的高水平免疫原性和保护能力，且具有交叉保护作用[26]。

3.2 灭活苗

灭活疫苗通常是通过甲醛等灭活剂灭活后制成，可以单独使用或与弱疫苗结合使用。灭活疫苗具有很高的安全性，但IBV灭活疫苗也面临着一些缺陷，如缺乏引起强烈的细胞免疫反应的能力和缺乏交叉免疫保护的作用。且需多次免疫,免疫程序相对繁琐。也有学者为了提高灭活苗的有效性，使用两种活的异源IBV疫苗和灭活苗进行接种，两种异源活疫苗的结合使用确实提高了IBV灭活苗的有效性[27]，但尚未达到理想状态。考虑到灭活苗和弱毒苗的局限性，近年来研究者开发了重组活载体IBV疫苗，它们显示出更高的安全性和有效性[28]。

3.3 新城疫病毒载体疫苗

近年来，重组活载体疫苗其安全性、遗传稳定性以及诱导对多种血清型病原体的免疫反应等优势而被广泛研究。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)载体疫苗是以表位为基础的活载体疫苗，主要由3个B细胞中和表位和4个T细胞表位组成，疫苗菌株命名为rNDV-IBV-T/B，给机体提供了对抗同源和异源IBV菌株挑战的能力[29]。由于rNDV-IBV-T/B疫苗菌株对高温敏感，次年又开发了重组可热型NDV载体疫苗，被称为rLS-T-HN-T/B[30]。目前人们普遍认为，重组活载体疫苗产生免疫效果较慢，且迄今为止所报道的使用病毒载体疫苗的结果并不完全令人满意，必须探索新的载体。

3.4 基因工程疫苗

基因免疫是20世纪90年代发展起来的生物技术,其安全性及高效性是传统疫苗所达不到的。它不仅可以诱导机体产生体液免疫,而且具有能够诱导强烈而持久的细胞免疫,避免机体向外界排毒这一优点。但由于NIBV具有高频率变异特点以及目前对其免疫保护机制尚不清楚，给高效可靠的疫苗研发带来困难。

3.5 核酸疫苗

RNA疫苗与DNA疫苗是核酸疫苗的两种类型，都是将目的基因与真核表达质粒连接，导入宿主体内，然后利用宿主的转录系统合成抗原蛋白[31]，从而诱导宿主产生免疫应答。核酸疫苗的使用安全有效，操作简便，成分单一，但却可构建多基因或多价疫苗，能同时诱导体液免疫和细胞免疫，可长期在宿主细胞内表达而使机体获得持续性的免疫力，具有较好的免疫原性。但幼龄动物的免疫系统发育不全，机体有一定概率会把外源基因序列表达的蛋白质误认为机体产生的正常物质，并且错误地整合到机体细胞基因组中，引起机体的病变[32]。

3.6 亚单位疫苗

亚单位疫苗是一种诱导机体产生体液免疫,来改善或控制病毒潜伏感染情况的新型疫苗,一般与佐剂配合使用来提高其免疫原性[33]。王月欣等人研制的S1亚单位疫苗能有效诱导机体产生高水平的抗体,尤其与QXL87活疫苗组合免疫时,免疫保护效果尚佳,为当前我国由QX型IBV引起的IB疾病提供更全面的防控[34]。亚单位疫苗与常规疫苗相比，它可以代表一种安全的改良的活疫苗，各年龄的鸡群都可以使用，安全性高，可批量生产，成本低廉；但有文献表明，该疫苗临床效果评估并不理想，因此亚单位疫苗未进行商品化推广[35]。

众所周知，IB控制的复杂性是由多种因素决定的，NIBV的生物学特性、IB的流行病学等问题，都需要不断地研究和探讨。新的预防战略必须克服旧的问题，如成本和管理的问题、交叉保护和变异的问题，必须将其知识和评估视为战略规划的基本必要条件。

4 小结与展望

近年来，肾型传气管炎病毒已成为传染性支气管炎病的重要致病原。全球对该病毒的研究也持续开展，并不断涌现出许多有关NIBV的毒株重组变异、致病机理以及新制备疫苗的报道，也在一定的程度上增强了疫苗效价，提高对动物的保护力。我国在NIBV领域中也取得一定的研究成果，但要提高NIBV的防护效率、降低NIBV的发病率仍然亟需进一步的发展。其次，病毒在机体内的感染过程、感染机制及其在机体中诱发的固有免疫和适应性免疫过程有待进一步研究。此外，该病毒具有很强的突变和重组能力，以及不正确的疫苗使用策略和不合理的养殖模式也会造成IB的大范围流行。因此，深入研究NIBV诱发IB的特点及其感染所导致的免疫调节反应，可为IB临床治疗措施提供更丰富的理论依据，也可为研制IB疫苗或抗病毒药物提供新的思路。