电子垃圾拆解区儿童尿液中6-羟基硫酸褪黑素水平的检测分析

罗 琼，霍 霞，陈梓涵，杨江夏，黄 宇，徐锡金，3

（1．汕头大学医学院环境医学与发育毒理学实验室，广东 汕头 515041；2．暨南大学环境学院，广东 广州 510632；3．汕头大学医学院细胞生物学与遗传学教研室，广东 汕头 515041）

褪黑激素是由松果体合成并有昼夜节律性分泌的一种具有调节生物节律、促进睡眠、调节免疫活性、调节能量代谢和抗肿瘤能力的神经内分泌激素。褪黑激素由色氨酸转化为5-羟色胺后，在5-羟色胺-N-乙酰转移酶和羟基吲哚-O-甲基转移酶的催化作用下合成[1-2]，经肝细胞色素P450酶的作用转化为6-羟基褪黑素，再与硫酸盐结合形成6-羟基硫酸褪黑素（6-sulfatoxymelatonin，aMT6s），其中70%～80%的aMT6s随尿液排出体外。晨尿中aMT6s浓度反映了夜间褪黑激素的最高水平[3]。研究表明，锰、铁、铜等金属在机体的累积会损伤神经系统，通过使神经元钙离子稳态失调、DNA修复受损和线粒体功能障碍等机制增加神经退行性疾病的发病风险[4]。同时，重金属可干扰多巴胺代谢、皮质醇释放等过程，从而扰乱机体的内分泌系统[5]；此外，重金素暴露亦可引起免疫细胞及炎症标志物水平的改变，对免疫系统产生消极的影响[6]。儿童作为环境污染的易感人群，且身体的各个系统正处于逐步发育完善阶段，比成年人更容易受到铅等重金属污染物的毒性影响[7]。因此，本研究通过分析电子垃圾拆解区儿童尿液中aMT6s和外周血血清中白介素-13的水平，探讨环境污染物暴露对儿童神经内分泌免疫调节功能的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2016年11—12月，共招募213名3～7岁儿童，平均年龄为（4.57±0.86）岁，其中暴露组105名（男56名，女49名）来自汕头市潮阳区贵屿镇（电子垃圾拆解区），参照组108名（男60名，女48名）来自汕头市濠江区（非电子垃圾拆解区）。所有参与儿童均未补充褪黑激素，无激素类药物应用史及慢性病史。本研究经汕头大学医学院伦理委员会审查通过，所有参与研究的儿童家长均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器

人 ProcartaPlex Human Cytokines Panel（34plex）试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）；人尿液aMT6s竞争酶免疫试剂盒（德国IBL international公司）；Luminex 200多功能流式点阵仪（美国Luminex公司）；Infinite M200 Pro光栅型全波长酶标仪（瑞士Tecan公司）。

1.3 方法

1.3.1 样本采集收集儿童晨尿（中段尿）15 mL，1 mL分装后置-20℃冰箱保存。采集儿童早晨空腹肘静脉血2 mL于真空无抗凝剂采血管中，置于冰盒中运送至实验室，3 000 r/min离心15 min后分离血清，200 μL分装后置-80℃冰箱保存。

1.3.2 尿液aMT6s检测取尿样于冰上解冻，1 500 r/min离心5 min，取10 μL上清液加500 μL分析缓冲液稀释，涡旋混匀；取10 μL标准品、质控品分别加500 μL分析缓冲液稀释，涡旋混匀；分别取标准品、质控品和样本各50 μL加入96孔微量滴定板；每孔中分别加入50 μL酶结合物和褪黑素硫酸盐抗血清；振荡器上500 r/min避光孵育2 h；缓冲液清洗4次；分别加入100 μL TMB底物液；500 r/min振荡器上避光继续孵育30 min；加入100 μL TMB终止液，摇匀；450 nm波长检测。并将所测得的aMT6s浓度值（单位为nmol/L）除以同一标本的尿肌酐浓度值（单位为mmol/L）来表示aMT6s的水平。

1.3.3 外周血血清白介素-13检测将儿童外周血血清样本送至杭州联科生物技术有限公司进行检测，采用ProcartaPlex Human Cytokines Panel（34plex）试剂盒对儿童外周血血清白介素-13水平进行分析，在Luminex 200多功能流式点阵仪上进行检测。

1.4 统计学方法

使用SPSS 23.0统计软件进行分析。非正态分布的计量数据以M(Q1，Q3)表示，用Mann-WhitneyU检验进行组间比较；正态分布的计量数据以±s表示，用独立样本t检验进行组间比较。采用Spearman相关分析判断儿童尿液aMT6s水平与血清白介素-13水平的关系。当P＜0.05时认为差异具有统计学意义。采用GraphPad Prism 9软件作图。

2 结果

2.1 两组儿童尿液aMT6s水平的分布特征及比较

两组儿童尿液中aMT6s水平为非正态分布，暴露组儿童aMT6s水平为59.30（37.81，94.04)，参照组儿童aMT6s水平为32.63（15.97，60.38），暴露组儿童aMT6s水平显著高于参照组（P＜0.01）；暴露组男童和女童aMT6s水平均高于参照组，差异具有统计学意义（P值均＜0.05），见图1。

图1 参照组和暴露组儿童尿液中aMT6s水平的比较

2.2 两组儿童外周血血清白介素-13水平的比较

两组儿童血清白介素-13水平为正态分布，暴露组儿童血清白介素-13水平为（6.88±5.41）pg/mL，参照组儿童血清白介素-13水平为（3.61±1.58）pg/mL，暴露组高于参照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

2.3 儿童尿液aMT6s与外周血血清白介素-13水平的关系

Spearman相关分析结果表明，儿童尿液aMT6s水平与血清白介素-13水平呈正相关关系（r=0.326，P＜0.001）。

3 讨论

褪黑激素除了具有调节生物节律、促进睡眠功能外，还参与调节免疫反应，调节促炎和抗炎细胞因子的水平，如白介素-1β、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ和白介素-10等[8]，并影响Th1/Th2细胞向Th1方向极化[9-10]。临床研究显示，脓毒症患者的尿aMT6s排泄量显著高于健康成人，并且白介素-6、肿瘤坏死因子-α与aMT6s水平呈显著正相关关系。提示在脓毒症期间，免疫活性细胞可能通过产生更多的褪黑激素对机体产生保护作用[11]。另一项关于哮喘儿童的研究发现aMT6s水平升高与丙二醛、8-羟基-2′-脱氧鸟苷水平升高显著相关，同时aMT6s水平升高与肺部弹性及肺部炎症改善相关[12]。以上研究提示褪黑激素水平的改变与机体免疫功能及炎症状态有关，而尿aMT6s含量的检测可反映疾病或环境污染物对机体内源性褪黑激素分泌状态的影响。

本研究显示暴露组儿童尿液中aMT6s和血清白介素-13水平显著高于参照组，这说明贵屿镇不规范的电子垃圾拆解方式所导致的环境污染物暴露可能会诱导内源性褪黑激素和炎症因子白介素-13水平发生变化。动物实验研究发现铅的毒性会损伤5-羟色胺能和多巴胺能系统并导致纹状体、大脑皮层、背侧海马等部位中5-羟色胺或其代谢产物的增加[13]，提示重金属暴露可能会影响内源性褪黑激素的水平。与文献[11-12]的研究结果相似，环境污染物暴露可能会诱导暴露组儿童体内产生更多的褪黑激素，从而进行自我保护。我们前期针对同一人群的研究发现，贵屿镇（暴露组）儿童体内血铅水平均显著高于濠江区（参照组），且暴露组儿童体内去甲肾上腺素浓度及脂蛋白相关磷脂酶A2、白介素-6等炎性介质的水平均发生了改变；表明重金属污染物暴露影响儿童神经内分泌的免疫调节功能[14-15]，但其中的机制仍需要进一步研究。尿液aMT6s与外周血血清白介素-13水平的正相关关系则提示神经内分泌和免疫系统之间存在着明显的关联，机体可以通过分泌褪黑激素对免疫系统进行调节[16]。提示褪黑激素可能在环境污染物暴露对机体神经内分泌免疫系统的不良影响中起着重要的作用。

综上所述，本研究表明电子垃圾拆解区环境污染物暴露对儿童神经内分泌免疫调节功能产生一定的影响，为进一步研究其发生机制提供了理论依据。