独活-桑寄生药对治疗类风湿性关节炎的网络药理学分析

陈若冰，魏秀娟，庄晓纯，黄国彬,4，陈小芸,4，陈一村

（1．汕头大学医学院第一附属医院静脉用药调配中心，广东 汕头 515041；2．汕头大学医学院药理学教研室，广东 汕头 515041；3．潮汕职业技术学院，广东 普宁 515300；4．广东维安检测科技有限公司，广东 普宁 515300）

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性炎症性自身免疫性疾病，表现为关节滑膜炎、关节软骨破坏、关节功能障碍等[1]。中医称为“痹症”、“顽痹”等[2]。症状为关节的疼痛、肿胀、僵硬，甚者伴有心血管、肺、骨骼等并发症[3]。由于发病机制尚不明确，目前尚未有能够完全治愈的药物。独活寄生汤由独活、桑寄生、杜仲、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、川芎、肉桂、防风、人参、甘草、当归、干地黄、芍药多味中药组成[4]。临床常用于治疗类风湿性关节炎等疾病[5]。独活、桑寄生为独活寄生汤的君药药对，是本复方制剂的重要组成部分。本研究利用网络药理学方法，对独活-桑寄生药对进行分析，探讨这一药对的药效物质、作用靶点和相关通路，预测其作用机制。

1 材料与方法

1.1 查找独活、桑寄生的有效成分和靶点

在TCMSP数据库（https://tcmsp-e.com/）查找独活、桑寄生两味中药的成分和靶点。筛选条件：口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，药物相似性（drug likenes，DL）≥0.18。通过UniProt数据库（https://www.uniprot.org/），限定物种为“Homo Sapiens”，将得到的靶蛋白转换成基因，删除重复基因，得到独活-桑寄生药对的靶点。导入Cytoscape3.7.2软件，绘制独活-桑寄生靶点网络图。

1.2 查找成分—疾病的交集靶点

在人类基因数据库GeneCards（https://www.genecards.org/） 和 DrugBank数据库 （https://go.drugbank.com/）中以“rheumatoid arthritis”为关键词，物种为“Homo Sapiens”，检索RA的疾病靶点。利用在线工具Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）绘制韦恩图，得到RA与独活-桑寄生的交集靶点。

1.3 构建蛋白-蛋白相互作用网络图

在 STRING 数 据库 （https://string-db.org/）中，输入交集靶点，物种选择“Homo sapiens”，构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，等值置信度为0.7，其余参数为默认值。保存结果中的csv文件，导入Cytoscape 3.2.7软件构建PPI网络图，根据Degree值的大小对数据进行可视化分析。

1.4 GO基因注释和KEGG通路富集分析

登录David数据库（https://david.ncifcrf.gov/），物种选择“Homo Sapiens”，对共同靶点进行GO和KEGG富集分析。将结果整理后，通过微生信平台（http://www.bioinformatics.com.cn/）绘制柱形图和气泡图进行可视化分析。

1.5 分子对接验证成分与靶点的结合能力

将有效活性成分与核心靶点进行分子对接。在PubChem网站（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）上下载有效成分的3D结构（sdf格式），然后在RCSB蛋白数据库（https://www.rcsb.org/）下载肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、蛋白激酶B（又称Akt1激酶）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）的结构（pdb格式），分别导入薛定谔软件Maestro 11.1中，先对蛋白分子进行结构优化、去除水分子、能量最小化，然后以小分子配体所在的位置为对接位点，进行分子对接，得到对接分数。

2 结果

2.1 独活-桑寄生药的有效成分靶点网络构建

通过检索得到独活-桑寄生有效活性成分11个（表1），独活的有效成分靶点54个，桑寄生的有效成分靶点145个，删除重复项后得到独活-桑寄生靶点170个。图1为有效成分与靶点的关系图，共有179个节点，251条边。根据Degree值设置节点的大小。Degree值排名前5的化合物有槲皮素、β-谷甾醇、O-乙酰二氢欧山芹酯、当归酮和欧前胡素。其中，槲皮素（SJS1）在网络中起着重要的作用，与146个靶点有关。成分DH9没有对应的靶点，在网络中未体现。

图1 独活-桑寄生成分靶点网络图

表1 独活-桑寄生有效成分

2.2 查找疾病靶点和交集靶点

通过GeneCards数据库，得到RA相关的靶基因5 017个，两次截取相关性评分（relevance scores）在中位数以上（≥2.61）的靶基因，得到1 259个靶基因。在DrugBank数据库中，查找到RA靶基因154个。合并去重后得到1 352个疾病靶基因。绘制韦恩图，找出与有效成分的交集靶点89个，见图2。

图2 药物—疾病靶点韦恩图

2.3 PPI网络的构建

将STRING数据库上获得的结果中的csv文件导入Cytoscape3.7.2，得到含85个节点和619条边的网络图（图3）。使用工具Network Analyzer进行分析，选择Degree设置节点大小和颜色深浅。Degree值越大，节点越大，颜色越深。Degree值在中位数以上的靶点有40个，其中TNF、Akt1、IL-6、JUN、TP53、RELA、IL1B、EGFR、CASP3、MAPK1等靶点与其他靶点密切联系，在PPI网络中起着重要的作用。

图3 独活-桑寄生治疗RA的共同靶点PPI网络图

2.4 交集靶点的GO和KEGG富集分析

GO富集分析共获得生物过程（biological process）380项，主要是干扰RNA聚合酶Ⅱ启动子、DNA模板转录的正调控、炎症反应等生物过程；细胞组成（cell components）35项，涉及细胞核、细胞外间隙、细胞质等；分子功能（molecular function）68项，涉及蛋白质结合、相同蛋白质结合及酶结合等。每个类别取基因数排名前10的项进行作图分析，见图4。其中，蛋白质结合（protein binding）的基因数最多。KEGG分析中获得97条通路。筛选出基因数排名前20的通路，绘制气泡图（图5）。结果显示，肿瘤通路（pathways in cancer）、乙型肝炎通路（Hepatitis B）、TNF信号通路（TNF signaling pathway）富集的基因数最多。这些通路中与炎症相关的通路见表2。

图4 交集靶点GO富集分析

图5 交集靶点的KEGG通路气泡图

表2 炎症相关的信号通路及涉及的靶点数

2.5 分子对接

对接分数为实验解离/抑制常数的负对数，其绝对值大于5表示化合物和靶点有较好的结合能力[6]。表3为独活-桑寄生药对有效成分与核心靶点的分子对接结果。其中当归醇D与TNF-α，异欧前胡素与Akt1，槲皮素与IL-6的分子对接分数绝对值较高。

表3 有效成分与核心靶点的分子对接结果

3 讨论

独活-桑寄生药对是独活寄生汤的君药成分，在该复方制剂中占核心地位。独活具有祛风胜湿止痛的功效。研究表明，独活的药理作用有抗炎、抗风湿、抗氧化和抗肿瘤[7-8]。桑寄生能补肝肾、强筋骨、祛风湿、安胎元，具有抗肿瘤、抗炎等多种药理作用[9]。

本研究运用网络药理学，先找到独活-桑寄生药对与RA的共同靶点，然后构建PPI网络，筛选出核心的靶点，其中肿瘤坏死因子TNF是关键的核心靶点。TNF在体内有α和β两种结构，其中TNF-α发挥主要的作用。TNF-α与其受体TNFR1结合后激活TNF信号传导通路，调控Caspase家族介导的细胞凋亡、NF-κB和JNK蛋白激酶的活化，引起炎症反应[10-11]。Akt在体内起调控细胞存活和凋亡的作用，包括Akt1、Akt2和Akt3，其中Akt1是PI3K/Akt通路的重要组成。在外界细菌、病毒等炎症因子刺激下，Akt蛋白被PI3K磷酸化激活，磷酸化Akt蛋白参与NF-κB、mTOR和JNK等炎症信号通路的激活[12-13]。IL-6是体内重要的炎症细胞因子，可促进细胞的增值与分化，IL-6还能促进激活STAT3信号通路，促使STAT3持续磷酸化，进一步抑制细胞凋亡和促进细胞增值。IL-6/STAT3信号通路可介导TNF-α、IL-1β等多种炎症因子的产生，引起一系列炎症反应[14]。独活-桑寄生对靶蛋白的调节作用，间接影响各种炎症信号通路，从而发挥抗炎作用。

类风湿性关节炎是一种复杂的慢性病，尚未有能够完全治愈的药物。目前的治疗药物以非甾体抗炎药为主，然而治标不治本，副作用较大，部分患者不能耐受药物，病情不能得到有效控制。近年来也出现了各种抗风湿药、生物制剂和合成靶向药物[15]，但是价格非常昂贵。从中医的角度入手，挖掘中药的宝库。其中，独活寄生汤治疗类风湿性关节炎的疗效显著，得到很多临床的证实。本研究通过网络药理学，找到独活-桑寄生药对的治疗靶点和相关通路，为其治疗作用提供理论的基础。同时，还需要通过试验的手段来验证这些理论，为中药复方制剂的疗效提供有力的科学依据。