吉尔吉斯斯坦传统酸马奶中乳酸菌的分离鉴定

丛琳，袁婧，刘文俊，孙志宏

(内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室 呼和浩特010010)

0 引言

酸马奶在吉尔吉斯斯坦又称为“Kymyz”，被当地人誉为国饮，通常用来招待远方贵客。传统酸马奶以木桶、瓷缸或塑料桶为容器，新鲜马奶为原料，前一天的酸马奶作为发酵剂，通过搅打，低温自然发酵而成。是一种主要产物为乳酸，酒精含量低的发酵乳饮品。相较于鲜马乳，酸马奶有更高的营养价值和保健效果。本研究采用纯培养方法对吉尔吉斯斯坦地区酸马奶中的乳酸菌进行分离纯化，应用16S rRNA基因序列分析方法对分离株进行鉴定，结合PacBio SMRT三代测序技术对酸马奶样品中的细菌多样性进行分析，以更好了解该地区自然发酵乳制品中乳酸菌的组成与种类，为乳酸菌的研究和开发利用提供菌株，为吉尔吉斯斯坦乳制品中微生物多样性研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

本研究10份酸马奶样品采集自吉尔吉斯斯坦境内，位于比什凯克、阿伦和奥什3个不同地区，所有样品由当地牧民采用传统自然发酵的方法家庭手工制作。现场将样品混匀后采集，一式两份。采集的样品一部分置于装有0.5 g灭菌缓冲剂（M淀粉:MCaCO3=50∶1）的2 mL无菌冻存管中，另一部分装入无菌离心管中，加入RNA/DNA样品保护液并充分混匀、标号。样品运输全程保持低温（2~8℃），到达实验室后立即进行乳酸菌分离培养实验，宏基因组测序样品于-80℃保存备用。

1.2 试剂及仪器

MRS培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；Agar Powder，北京康倍斯(chembase)科技有限公司）；TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生化科技（北京）有限公司；DneasyPowerFood Kit，德国QIAGEN公司；KAPA HiFi HotStartReadyMix PCR Kit，美国KAPA公司。

微量紫外分光光度计，美国Nanodrop公司；PCR仪，美国Life Technologies公司；电泳仪，北京六一仪器厂；凝胶成像仪，美国UVP公司；三代测序仪PacBio RS II，美国Pacific Biosciences公司。

1.3 乳酸菌分离与鉴定

自然发酵乳制品中乳酸菌计数采用倾注培养法[1]。将样品充分混匀后用10倍梯度稀释法[2]选取合适的浓度梯度（10-5，10-6，10-7）对自然发酵乳制品进行梯度稀释。吸取1 mL样品稀释液于未凝固的MRS固体培养基中摇匀，待培养基彻底干透后置于37℃恒温培养箱需氧培养48~72 h。同时，吸取与活菌计数相同稀释倍数的样品稀释液涂布于MRS固体培养基上，待菌落形成后，挑取形态特征各异的单个菌落在相应的固体培养基上采用平板划线法进行2~3次的划线纯化[3]。把镜检结果为单一菌落形态的菌落进行传代培养，将经革兰氏染色后呈阳性、过氧化氢酶试验显阴性、菌落无芽孢且形态均一的纯培养物定为疑似乳酸菌，加入适量脱脂乳保护剂进行保藏并编号。

乳酸菌分离株DNA提取使用TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒，按照说明书的步骤严格操作。取得DNA后，用ND-1000紫外分光光度计检测提取DNA的纯度。将符合要求的DNA作为扩增模板进行扩增体积为50μL的PCR反应，具体包括模板DNA（100~300 ng/mL）2μL，细菌通用引物正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）1.5μL，反向引物1492R（5′-ACCTTGTTACGACTT-3′）1.5μL，引物浓度均为10μmol/L，10×PCR Buffer（含Mg2＋离子）5μL，Taq DNA polymerase 0.5μL，dNTP 4μL，ddH2O 35.5μL。扩增条件为94℃预变性5 min，94℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，30个循环，72℃末端延伸10 min[4]。

上述PCR产物需在1.0%的琼脂糖凝胶电泳中检测，将满足测序要求的PCR扩增产物在低温条件下送往上海美吉生物公司进行纯化和双向测序。

1.4 同源性分析及系统发育树的构建

运用DNAStar 5.01软件中的SeqMan拼接经上海美吉生物公司测序的16S rRNA序列，将拼接好的序列在NCBI（National Center for Biotechnology Infornation）上进行BLAST（Basic Local Alignment Search Tool，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）同源性比对，将同源性大于99%且基因片段吻合的DNA序列认定为与模式菌株属于同一菌种，运用MEGA 7.0软件采用邻接法（Neighbor-Joining）构建菌株序列进化树，比较它们之间的亲缘关系进化距离。

1.5 酸马奶样品中宏基因组DNA的提取

使用DneasyPowerFood Kit，2 mL tubes（100）抽提样品宏基因组DNA，其步骤参照试剂盒中的说明书[5]。用ND-1000紫外分光光度计和1.0%琼脂糖凝胶电泳检验提取DNA的浓度、纯度与完整度，将DNA纯度OD260/280处于1.8~2.0之间，浓度大于20 ng/μL，且片段化程度小的DNA置于-20℃低温冰箱保存备用。

1.6 细菌16S rRNA基因序列全长扩增

将提取好的细菌基因DNA作为模板，通过16SrRNA基因序列通用引物（正向引物27F和反向引物1492R）进行扩增，通过在引物5′端加不同的核苷酸标签（Barcode）来区分各样品。PCR扩增所需的试剂盒为KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR Kit，扩增反应体系为50μL：10μmol/L正反向引物各1.5μL，模板DNA 1.5μL，模板浓度需小于100 ng/μL，KAPA Mix 25.0μL，最后用ddH2O补足体系至50μL。扩增条件为：95℃预变性3 min，98℃变性20 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃末端延伸2 min[6]。

1.7 PacBio SMRT测序及数据分析

将经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后符合要求的PCR产物纯化后混样，用SMRTbell Template Prep Kit 1.0试剂盒对混样DNA进行DNA损伤修复和DNA双链部分缺失碱基修复。修复纯化后的DNA加接头，以Qubit 2.0荧光计检测制备文库的浓度，再用PacBio RS II三代测序仪对构建完成的DNA文库进行上机测序。对得到的原始数据进行质量控制，具体的条件为：测序的最小循环次数为5；测序的最小预测精确度为90%；测序时DNA插入片段应属于1 400~1 800 nt之间。将满足要求的高质量序列根据每个样品的Barcode信息进行去除Barcode处理[7]，用QIIME平台对符合要求的高质量序列进行微生物组分析，通过柱形图、折线图、散点图展现不同水平上不同自然发酵酸马奶中的的菌群结构，用Mann-Whitny/Kruskal-Wallis检验统计吉尔吉斯斯坦不同地区酸马奶菌落结构的差异性，应用R 3.5.0和Origin 2019等软件对QIIME分析的微生物组数据进行可视化处理。

2 结果与分析

2.1 自然发酵酸马奶中乳酸菌总数计数与分离

本研究中10份自然发酵酸马奶通过纯培养后的乳酸菌总数在6.80×105~3.04×109mL-1范围之间，具体结果如表1所示。

表1 吉尔吉斯斯坦酸马奶中乳酸菌计数结果 mL-1

乳酸菌总数能够反映发酵乳制品的新鲜程度，展现发酵乳制品在运输、储藏等过程中菌株的生长状态。孙天松等[1]曾研究哈萨克斯坦的不同地区传统酸马奶中的乳酸菌多样性，揭示该地区酸马奶样品乳酸菌总数均大于1.00×106mL-1。由此可以推测吉尔吉斯斯坦地区自然发酵酸马奶的新鲜程度较好，乳酸菌的存活能力较高。

本研究中10份酸马奶样品共分离得到109株菌，经革兰氏染色呈阳性、过氧化氢酶试验显阴性结果筛选后得到疑似乳酸菌共91株。通过观察菌落形态，其菌落边缘呈整齐或不平，菌落表面呈粗糙或光滑，菌落中央有凸起或凹陷，菌落颜色呈白色、乳黄色或接近于透明。在显微镜下观察发现，经革兰氏染色后的疑似乳酸菌分离菌株形态呈均匀排列的杆状、球状或椭球状，排列呈对、呈链、成片或呈环状。

2.2 乳酸菌分离菌株鉴定结果

经同源性序列比对（BLAST）结果显示，91株分离株均为乳酸菌，将其16S rRNA基因序列与模式菌株的16S rRNA基因序列利用MEGA7.0软件绘制乳酸菌序列进化树。通过图1（比例尺为0.01）的系统发育树分析可知，分离到的91株乳酸菌分离株为2个属11个种，包括植物乳杆菌（Lb.plantarum）、马乳酒样乳杆菌（Lb.kefiranofaciens）、副干酪乳杆菌（Lb.paracasei）、干酪乳杆菌（Lb.casei）、哈尔滨乳杆菌（Lb.harbinensis）、发酵乳杆菌（Lb.fermentum），德氏乳杆菌（Lb.delbrueckii）和瑞士乳杆菌（Lb.helveticus）等。

图1 部分乳酸菌分离株16S rRNA基因序列的系统发育树

经纯培养从吉尔吉斯斯坦地区的10份酸马奶样品中分离共91株乳酸菌，其中副干酪乳杆菌为优势菌种，占所有分离株的29.67%，除KG12，KG15和KG26样品外，其余样品均有分离，具体结果如表2所示。

表2 吉尔吉斯斯坦酸马奶中乳酸菌分离鉴定结果

2.3 吉尔吉斯斯坦自然发酵酸马奶的细菌多样性

2.3.1 α多样性

经过SMRT三代测序，10份吉尔吉斯斯坦自然发酵酸马奶共获得32 553条高质量DNA序列，平均每个发酵乳样品获得3 255条DNA序列。其中KG12样品获得的代表性OTUs最少，为146条，KG17样品获得的代表性OTUs最多，为488条。吉尔吉斯斯坦比什凯克、阿伦和奥什3个地区酸马奶的Chao1指数分别为（445.94±207.47）、（294.38±0.00）和（308.29±53.76）；发现物种数分别为（206.50±163.00）、（163.00±0.00）和（144.67±31.64）；香农指数分别为（4.22±1.39）、（3.11±0.00）、（5.08±0.25）;辛普森指数分别为（0.74±0.19）、（0.58±0.00）、（0.93±0.02）。通过比较发现，奥什地区的酸马奶细菌群落多样性和种数较其他两个地区更为丰富,具体如表3所示。

表3 吉尔吉斯斯坦酸马奶的测序序列信息和α多样性指数

2.3.2 β多样性

分析吉尔吉斯斯坦不同地区酸马奶的菌群多样性变化，通过PC1（第一主成分）和PC2（第二主成分）进行主坐标分析，基于加权距离的主坐标分析PC1坐标和PC2坐标的贡献率分别为77.5%和13.17%，基于非加权距离的主坐标分析PC1坐标和PC2坐标的贡献率分别为29.92%和14.19%。从图中可以看出，采集于吉尔吉斯斯坦不同地区的酸马奶制品有明显的分离状态，同时存在一定的交叠，如图2所示。

图2 不同地区酸马奶制品中菌群主坐标分析

2.3.3 细菌组成

经检测，吉尔吉斯斯坦10份自然发酵酸马奶细菌在细菌门水平的组成主要分为4个菌门，除厚壁菌门外，还有变形菌门、拟杆菌和极少量的蓝藻细菌。其中，厚壁菌门是吉尔吉斯斯坦自然发酵酸马奶制品中的主要菌门，相对占比的均值为98.38%，是绝对优势菌门。除绝对优势菌门厚壁菌门外，不同地区不同样本的酸马奶制品中细菌门的相对占比各不相同，不同样本细菌门水平组成如表4所示。

表4 不同酸马奶中细菌门水平组成 %

在细菌属水平，吉尔吉斯斯坦10份自然发酵酸马奶样品中共检测到20个细菌属。主要由乳杆菌属、乳球菌属这2个乳酸菌属构成。其中，KG12酸马奶样品中有相对占比最高的乳杆菌属，达99.92%；KG23酸马奶样品中有相对占比最高的乳球菌属，为12.97%。通过进一步分析可知，吉尔吉斯斯坦自然发酵酸马奶中还有一些相对占比小于1%的细菌菌属，如克吕沃尔菌属、沙雷氏菌属、土芽孢杆菌属、魏斯特菌属等，研究发现不同地区酸马奶细菌属种类及相对占比不同，不同地区酸马奶制品细菌属水平组成如图3（a）所示。

图3 不同酸马奶细菌组成

在细菌种水平，10份样品共检测到30个细菌菌种，在所有样品中相对占比大于1%的除了有瑞士乳杆菌（48.04%）和哈尔滨乳杆菌（11.68%）外，还有类谷糠乳杆菌（6.11%），德氏乳杆菌（5.69%），马乳酒样乳杆菌（4.52%），发酵乳杆菌（3.79%），食二酸乳杆菌（3.21%），桥乳杆菌（3.01%），乳酸乳球菌（2.06%），副干酪乳杆菌（1.20%），牛粪乳杆菌（1.14%）等。除含量较多的菌种外，吉尔吉斯斯坦自然发酵酸马奶样品中还检测出一些低丰度（相对占比小于1%）的菌种，不同发酵乳制品细菌种水平组成见图3（b）。

测序中发现的细菌菌种包含了纯培养中获得的所有分离菌株种类，其中瑞士乳杆菌为绝对优势菌株，这与在纯培养中优势菌株为副干酪乳杆菌的结果并不相同。

2.3.4 核心微生物分析

核心微生物通常表示每个OTU在样品中出现的频率[8]，通过核心微生物组成有助于分析不同发酵乳制品微生物群落的特征。通过分析可知，吉尔吉斯斯坦酸马奶样品种水平的核心微生物为瑞士乳杆菌，其次为哈尔滨乳杆菌、类谷糠乳杆菌、德氏乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、发酵乳杆菌、食二酸乳杆菌、桥乳杆菌、乳酸乳球菌、副干酪乳杆菌、牛粪乳杆菌等，酸马奶样品的核心微生物组成如图4所示。

图4 酸马奶中核心微生物组成

2.3.5 OTU水平的菌群分析

通过Venn图对吉尔吉斯斯坦不同地区采集的发酵酸马奶制品OTU（代表性序列）的组成分析，根据不同OTU在酸马奶制品中的丰度计算出不同样品间的共有或特有OTU[9]。由图5可知，比什凯克地区采集的酸马奶有211个特有OTU，奥什地区有132个特有OTU，阿伦地区有125个特有OTU。比什凯克，奥什和阿伦3个地区采集的酸马奶的共有OTU有30个，占总OTU的4.47%。其中，奥什和阿伦地区的共有OTU为2个，只占OTU总数的0.3%。结果表明不同地区的发酵乳制品之间菌群的共性各有不同，其中奥什地区与阿伦地区的差异最大。

图5 不同采样地区酸马奶中的特有OTU分析

3 讨论

通过传统纯培养方法从吉尔吉斯斯坦10份自然发酵酸马奶中分离得到91株乳酸菌菌株，属于2个属，11个种。样品的优势菌种为副干酪乳杆菌，占所有酸马奶样品分离株的29.67%，这与乔健敏[10]等人研究的内蒙古地区自然发酵酸马奶中乳酸菌组成结果符合。通过PacBio SMRT测序方法分析酸马奶后，发现样品中的细菌隶属于4个门，20个属，30个种。优势细菌属为乳杆菌（93.98%），优势细菌种为瑞士乳杆菌（48.04%）和哈尔滨乳杆菌（11.68%）。与刘文俊等[11]研究的蒙古国的传统酸马奶中的乳酸菌组成结果类似。孙志宏等[12]通过高通量测序法研究tarag（自然发酵乳制品）中的细菌和真菌多样性、种群结构等，发现目前研究中使用的瑞士乳杆菌分离物中存在3个亚群，且大多数来自特定生态起源的瑞士乳杆菌菌株都有特定的种群结构，这可能是酸马奶样品中的优势菌种为瑞士乳杆菌的重要原因之一[13]。吉尔吉斯斯坦境内酸马奶的细菌组成在3个地区之间也存在一定差异：瑞士乳杆菌是比什凯克与阿伦地区的优势菌种，奥什地区的优势菌种为哈尔滨乳杆菌。在3个地区中，奥什地区的细菌多样性最高，阿伦地区的酸马奶样品中菌群丰富度最低。

4 结论

本文通过纯培养和非培养技术研究了吉尔吉斯斯坦10份自然发酵酸马奶中的乳酸菌与细菌组成，共分离得到91株乳酸菌。通过PacBio SMRT分析后，发现该地区优势细菌种为瑞士乳杆菌（48.04%），酸马奶中的细菌组成、细菌数量及优势菌种存在地域差异。本研究保存的乳酸菌资源和报道的自然发酵酸马奶细菌图谱，有助于后续帮助当地传统发酵乳的发展。此外，我们需要关注传统发酵乳的发酵环境和工艺，避免一些条件致病菌带来的食品安全问题。