具有胆固醇降解能力的人源乳酸菌筛选及其特性研究

李奕莛，刘璐，赵军英，乔为仓，陈君，刘彦品，侯俊财，陈历俊

（1.东北农业大学 食品学院，哈尔滨 150030；2.北京三元食品股份有限公司 国家母婴乳品健康工程技术研究中心北京市乳品工程技术研究中心母乳研究技术创新中心，北京 100163）

0 引言

胆固醇是参与人体生长代谢活动中的重要营养物质，但血清中胆固醇水平过高也会造成负面影响，研究表明血清胆固醇水平过高容易发生全身动脉粥样硬化，从而导致心脏病，脑梗死等疾病[1]。随着生活水平的提高，我国居民血清总胆固醇水平呈直线上升，2015年中国成年人血脂异常患病率为37.5%，其中高胆固醇血症患病率高达9.6%，高胆固醇疾病严重影响了我国居民的身体健康[2]。

目前对于胆固醇疾病的最主要的治疗方式为药物治疗，但药物治疗存在成本高、副作用大、治疗周期长等弊端；此外还可以进行饮食干预，但饮食干预不好控制，对患者自控能力要求严格；应用乳酸菌来降低血清胆固醇成为当前的研究热点。近年来众多研究表明，当患者的血清胆固醇含量下降后，诱发其他疾病的可能性也显著降低[3]，许多动物及临床实验也证明了通过乳酸菌来降解胆固醇是一种可行的方式[4-5]。肠道中的乳酸菌，对维持肠道微生态以及提高免疫能力有重要作用，因此通过乳酸菌来治疗和预防胆固醇及心血管疾病是未来的有效途径[6]。

人体肠道环境中含有丰富多样的人源益生菌群，相较外源乳酸菌，人源乳酸菌能够更好的适应人体胃肠道环境，且有研究表明人源乳酸菌能够更好的定植于肠道环境，并与其他菌群发挥协同作用使菌株的益生效果更加显著[7]。同时，人源乳酸菌为人体固有益生菌，能够有效避免因外源乳酸菌摄入而导致的肠道菌群失衡，是一种潜在的更为安全有效的治疗和预防高胆固醇疾病的益生菌[8-9]。因此，本研究旨在从28株人源乳酸菌中筛选具有降胆固醇能力、特性良好的人源乳酸菌，为开发治疗和预防高胆固醇疾病的产品提供技术理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株样本，保存于北京三元食品股份有限公司母婴研究中心；邻苯二甲醛、胆固醇，国药集团化学试剂有限公司；牛胆盐，北京市海淀区微生物培养基制品厂；MRS培养基，北京陆桥技术股份有限公司；PBS磷酸缓冲液、牛磺脱氧胆酸钠，北京索莱宝科技有限公司；冰醋酸、盐酸和硫酸等均为分析纯，罗恩试剂。

1.2 仪器与设备

全自动高压灭菌锅，湖北永大换热设备有限公司；生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；冷冻离心机，德国SIGMA公司；超净工作台，艺斯高贸易有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株活化

从-80℃冰箱中取出甘油保存的菌液接种于MRS液体培养基中，一代菌液按1∶1的比例保存至灭菌后的30%甘油-80℃进行保存，试验所用菌株菌活化三代后使用。

1.3.2 降解胆固醇菌株的初筛

采用邻苯二甲醛法测定培养基中的胆固醇含量。取胆固醇含量为0.2 g/L培养基0.2 mL，邻苯二甲醛工作液0.2 mL，冰醋酸2.6 mL，浓硫酸2.0 mL，混匀均匀后，室温下静置15 min，于550 nm处测定吸光度[10]。实验测定邻苯二甲醛标准曲线为y=17.32x-0.0043 R2=0.9983。

式中：N1-胆固醇总含量；N0-上清液中胆固醇含量。

1.3.3 胆固醇同化量、沉淀量试验

（1）沉淀量试验。

将乳酸菌发酵液于4℃下12 000 g离心10 min，得到沉淀，将沉淀用pH值7的磷酸钠缓冲液洗涤2次，同一条件离心，得到的上清液即为沉淀洗液，计算公式如下：

式中：B为沉淀率；C总为总胆固醇含量；C沉为PBS洗脱液中胆固醇含量。

（2）同化量试验。

胆固醇在发酵过程中减少，并且没有在沉淀中出现的部分为胆固醇同化量，结果计算如下：

式中：A为同化率；C总为总胆固醇含量；C上为上清液中胆固醇含量；C沉为PBS洗脱液中胆固醇含量。

1.3.4 胆盐水解酶定性试验

将乳酸菌在含有5 mg/L牛磺脱氧胆酸钠盐和0.37 g/L氯化钙的MRS固体培养基中厌氧条件下37℃培养72 h。以菌落产生的不透明晕圈或不透明颗粒状白色菌落特征表示胆盐水解酶活性[11]。

1.3.5 特性试验

耐酸试验：无菌条件下将活化并富集3次后的乳酸菌菌株稀释至108CFU/mL，离心后去除上清液，用PBS缓冲液洗涤3次后分别置于pH 1.5、pH 2.0、pH 3.0的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养，分别在0、1、3 h取样并用PBS缓冲液梯度稀释后取100μL涂布于MRS平板，每个稀释度3个平行，37℃培养48 h后计数[12]。

耐胆盐试验：步骤同耐酸试验，洗涤后置于含有0.3%牛胆盐的MRS液体培养基中。

2 结果与分析

2.1 28株人源乳酸菌胆固醇总降解能力的初步筛选

本试验对菌库中现有的28株人源乳酸菌进行活化后通过邻苯二甲醛法对其进行胆固醇降解率进行初步测定，其中母乳来源的菌株23株，婴儿粪便来源的菌株5株。

胆固醇降解结果如图1所示，共有13株乳酸菌降解率达到了20%以上，其中格氏乳杆菌F020、F024降解率最高，且均为婴儿粪便来源，降解率高达31.62%、31.11%。同时，来自母乳的B1-26至B1-30菌株的胆固醇降解率也较好，均为25%左右，降解率最低的菌株为来自婴儿粪便的格氏乳杆菌F002，降解率仅有2.61%，其次是来自母乳的植物乳杆菌R9（4.13%）；陈怡婷与吴慧昊等人进行的乳酸菌降解胆固醇实验中，菌株最高降解率也在30%~35%之间[13-14]，因此本实验测得乳酸菌具有较高的降解能力。根据试验结果最终选择了降解率高的前6株乳酸菌作为后续试验菌株。

图1 28株人源乳酸菌胆固醇降解率

2.2 6株胆固醇降解能力较强的人源乳酸菌的胆固醇同化量、沉淀量的测定

乳酸菌在含有游离胆盐的培养基中可以发生共沉淀作用，胆盐水解酶（Bile Salt Hydrolase，BSH）可以特异性结合含有酰胺键的胆汁酸，释放出游离的胆汁酸与牛磺酸、甘氨酸参与胆固醇的代谢从而降解胆固醇；此外，乳酸菌可以通过同化作用降解胆固醇，还可以通过细胞壁对胆固醇进行吸附以及细胞质膜对胆固醇进行吸收[15]。

如图2所示，沉淀作用最强的为格氏乳杆菌F020，沉淀率10.49%；同化作用最强的为格氏乳杆菌F024，同化率25.93%，但格氏乳杆菌F024沉淀率最低为5.19%，格氏乳杆菌B1-29的同化率最低，比格氏乳杆菌F024少10.01%；由此可以看出总降解率较高的格氏乳杆菌F020、F024其沉淀作用与同化作用也相对较高，具有良好的胆固醇降解能力。

图2 6株人源乳酸菌胆固醇沉淀量与同化量

2.3 6株胆固醇降解能力较强的人源乳酸菌的胆盐水解酶定性分析

6株乳酸菌在添加牛磺脱氧胆酸钠的培养基中均产生不透明的白色菌落沉淀圈，如图3所示，因此6株乳酸菌均具有胆盐水解酶活性，这是由于在试验中，被生物酸化的培养基出现解共轭作用形成的游离胆汁酸质子化引起的[16]。其中格氏乳杆菌B1-26的沉淀圈最小直径为8.07 mm，罗伊氏乳杆菌B1-28产生的沉淀圈最大为11.27 mm，其他4株乳酸菌沉淀圈在9.87~10.31mm之间，因此罗伊氏乳杆菌B1-28的BSH活性最高。研究发现清除胆固醇的主要机制与细胞的BSH活性有关[17]，通过解共轭胆盐释放未共轭的胆汁酸，诱导胆固醇的沉淀。

图3 6株人源乳酸菌胆盐水解酶定性

综合6株人源乳酸菌体外降解胆固醇的试验结果，分别选取总降解率最高的格氏乳杆菌F020，同化量最高的格氏乳杆菌F024，胆盐水解酶活性最强的罗伊氏乳杆菌B1-28进行耐酸耐胆盐特性试验。

2.4 3株胆固醇降解能力较强的人源乳酸菌的耐酸试验

人体在进食后会分泌大量胃酸使胃内pH值下降至2-3左右，从而更有利于消化酶消化食物，而乳酸菌只有在低pH的条件下存活才能进入人体肠道发挥作用[18]。因此对上述3株人源乳酸菌进行酸性环境的耐受性试验，分别选取了pH 1.5、2.0、3.0三个梯度，研究乳酸菌在1 h与3 h的活菌数及存活率。

如图4所示，在pH为1.5的条件下格氏乳杆菌F020、F024的活菌数菌均小于104CFU/mL存活率小于0.1%，因此格氏乳杆菌对该浓度的酸性条件不耐受；而格氏乳杆菌F020在pH为2.0与3.0件下的活菌数一直在增加，并且都大于100%，而格氏乳杆菌F024在该条件下存活率较低，pH 2.0条件下3 h后菌株的存活率降到了1.03%，pH 3.0时存活率仅有34.38%，总体存活率较低；罗伊氏乳杆菌B1-28在3个浓度的酸性条件下1 h存活率都不足10%，3 h均低于25%。综合上述结果，F020的对酸性条件的耐受性最好。

图4 3株人源乳酸菌在不同酸性条件下的耐受性

2.5 3株胆固醇降解能力较强的人源乳酸菌的耐胆盐试验

经过胃消化吸收后的乳酸菌进入小肠，小肠中胆盐会影响乳酸菌生长繁殖，因此，对胆盐耐受性良好的乳酸菌是在肠道中存活、定植，发挥益生作用的前提[19]。本试验在培养基中添加0.3%胆盐，研究乳酸菌在1 h与3 h的活菌数及存活率，结果如图5所示。

图5 3株人源乳酸菌在0.3%胆盐条件下的耐受性

在培养基中培养1 h罗伊氏乳杆菌B1-28对胆盐的耐受性最好，达到了82.98%，但在3 h时格氏乳杆菌F020的耐受性最好，达到了102.94%，而B1-28的存活率则降低到了74.47%，格氏乳杆菌F024在0.3%胆盐浓度下的活菌数降低到了104CFU/mL，存活率不足0.1%，对胆盐的耐受性最差；由此可以看出在0.3%的胆盐浓度下，格氏乳杆菌F020的耐受性最好，可在0.3%胆盐浓度下生长繁殖。

3 结果与讨论

本研究以人源乳酸菌为研究对象，筛选出具有胆固醇降解能力并且特性良好的人源乳酸菌。实验结果表明本菌库中人源乳酸菌降解率最高达到了31.62%，而陈怡婷的研究得到从发酵食品中得到的乳酸菌胆固醇降解率为35.33%[13]，表明本研究中的人源乳酸菌具有良好的胆固醇降解能力并且相对于外源乳酸菌，有良好的人体环境的适应能力，更有利于定植在肠道中发挥作用。胆固醇降解能力高的乳酸菌同时具有较高的能力的沉淀作用，乳酸菌对胆固醇的降解与细胞的胆盐水解酶活性有重要关系，通过解共轭胆盐释放未共轭的胆汁酸，诱导胆固醇的沉淀[20]；本实验6株乳酸菌虽都具有胆盐水解酶活性，但对于胆固醇的降解能力并不相同，这是由于胆盐水解酶受不同基因的调控，所以不同种属间具有较大差异，即使相同种属下，乳酸菌的胆固醇降解能力也不相同[21]。乳酸菌可以耐受肠道环境在肠道中定植是发挥乳酸菌功能性的先决条件。格氏乳杆菌F020的耐受性最好，可以在低pH和高胆盐条件下进行生长繁殖。陈大卫等人也研究发现具有胆固醇降解能力的人源乳酸菌同时具有较好的耐酸耐胆盐能力[22]。由于消费者对健康生活方式的渴望以及对来自天然来源的具有增强营养和治疗价值的食品的需求增加，食品行业对所谓的功能性食品表现出越来越大的兴趣。Sahoo等人将从本地乳制品中筛选出的高胆固醇降解能力乳酸菌加入调制乳中进行发酵，发现对小鼠的血清胆固醇具有明显的改善[23]。综上，本研究筛选出格氏乳杆菌F020胆固醇降解能力良好，对酸性及胆盐环境耐受性强，具有潜在的应用价值。