紫河车饮片干浸膏粉及配方颗粒的位点特异性PCR鉴别△

赵玉洋，秦雯，李源森芋，袁媛*，金艳，张辉，蒋超*

1.中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700；2.北京城市学院，北京 100083；3.华润三九医药股份有限公司，深圳 518029

紫河车（Placenta Hominis）为健康人的干燥胎盘，具有温肾补精、益气养血之功效[1]。生血丸、安坤赞育丸、补肾固齿丸、河车大造丸、益血生胶囊等中成药均含有紫河车。近年来，由于紫河车来源稀缺，药材市场上充斥着使用猪、牛、羊的胎盘冒充紫河车的现象，大大降低了紫河车临床用药的安全性和有效性[2]。历版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）收载的紫河车质量标准简单，检测指标缺乏专属性，不易鉴别药材及其产品的真伪。

中药配方颗粒是由单味中药饮片经水提、浓缩、干燥、制粒而成，经中医临床配方后，供患者即冲即服的颗粒[3]。中药干浸膏粉为中药材经提取、分离、浓缩后的浸膏干燥后所得的物料，也是制备中药颗粒剂、片剂、胶囊剂等固体制剂的中间物料[4]。研究表明，目前配方颗粒存在制剂原料以次充好、药材品种混用严重、产品质量优劣不一等问题[5‑7]。传统的中药饮片可以通过性状鉴别进行客观评价，但中药配方颗粒及浸膏通过加工制备后失去了原料的性状特征，因此，需要建立针对中药配方颗粒和干浸膏的合理、科学、快速、简便的检验方法[8‑9]。

与传统鉴别方法相比，聚合酶链式反应（PCR）技术最大的特点是不受样品形态限制，对于中药材、中药饮片乃至含有生药原粉的中药剂型均可应用，具有准确性高、重复性好等优势[10]。李慧等[11]利用位点特异性PCR 方法成功鉴别了红天麻、乌天麻及其杂交天麻。田娜等[12]建立的多重位点特异性PCR鉴别方法,可同时鉴别沪地龙和广地龙。孟虎彪等[13]使用位点特异性PCR 技术建立了一种稳定、准确鉴定牛膝和川牛膝配方颗粒的方法。崔占虎等[14]建立了一种药材水提液DNA 提取方法，并利用位点特异性PCR 方法鉴别断肠草与金银花类药材水提液基原。相关研究依据金银花差异单核苷酸多态性（SNP）位点建立了一种位点特异性PCR方法鉴定金银花植物及其配方颗粒真伪[15‑16]。

《中国药典》2020 年版收载了分子生物学检查法1001“聚合酶链式反应法”[17]，特异性PCR 鉴定已广泛应用于中药材提取液、中成药、贵细药材、配方颗粒的基原鉴定中，不仅为特异性药材的鉴别提供解决方法，也提高了临床用药的安全性。本文拟建立紫河车饮片、干浸膏粉及配方颗粒PCR 鉴别方法，为规范紫河车及其产品质量提供检测工具。

1 材料

1.1 仪器

Veriti™型PCR仪、GeneAmp 9700型PCR仪（美国Applied Biosystem 公司）；PTC‑100 型PCR 仪、SYNGENE 型凝胶成像系统（Gene 公司）；TC‑512型PCR仪（上海Techne公司）。

1.2 试药

紫河车饮片（批号：ZHC001～013）及混伪品羊胎盘（批号：YTP001～029）由华润三九医药股份有限公司提供；猪（学名：Sus scrofa）购于北京第五肉联厂；牛（学名：Bos taurus）购于鲜汇生鲜超市。凭证标本经中国中医科学院中药资源中心蒋超副研究员进行形态鉴定后，保存于中国中医科学院中药资源中心。

紫河车干浸膏粉样品由华润三九医药股份有限公司提供，紫河车配方颗粒样品购自华润三九医药股份有限公司，配方颗粒企业分别为A、B、C、D，见表1。

表1 紫河车实验材料来源信息

Wizard®SV Genomic DNA Purification System 试剂盒（美国promega 生物公司，批号：A2360）；DNeasy®Blood &Tissue Kit 试剂盒、QIAquick Nucleotide Removal Kit 试剂盒（德国凯杰生物技术有限公司，批号分别为69504、28306）。

2×M5 SuperTaqPCR Master Mix（北京聚合美生物技术有限公司，批号：MF164‑01）；rTaqDNA聚合酶（批号：R001B）、Mighty Amp DNA 聚合酶（批号：R071A）、TaqDNA 聚合酶（批号：M0273）均购自大连TaKaRa 公司；Trans 2K DNA Marker（北京全式金生物技术有限公司，批号：BM101）。

2 方法

2.1 DNA提取

分别使用Wizard®SV Genomic DNA Purification System 试剂盒、DNeasy®Blood&Tissue Kit 试剂盒、QIAquick Nucleotide Removal Kit 试剂盒，依据说明书操作步骤提取紫河车饮片、干浸膏粉及配方颗粒的DNA。样品模板DNA提取后，置-4 ℃保存。

2.2 引物设计

从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载中药紫河车及混伪品牛、羊、猪COⅠ序列，使用引物设计软件Premier Primer 5.0 设计鉴别引物覆盖中药紫河车COⅠ序列，筛选引物稳定区间，使用BioEdit 软件将紫河车引物稳定区间与混伪品牛、羊、猪进行对应的序列对齐，识别稳定区间内差异SNP鉴别位点；使用Primer Premier 5.0软件设计紫河车配方颗粒特异性鉴别引物（图1）。ZHC492F：5′‑AAACCCCCTGCCATAACC‑3′；ZHC492R：5′‑GAGGTTGCGGTCTGTTAGTAGTA‑3′由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

图1 紫河车特异性鉴别引物设计

2.3 PCR扩增条件

使用上述特异性鉴别引物对紫河车饮片及其干浸膏粉、配方颗粒总DNA模板进行扩增，初始PCR反应体系：反应总体积为25 μL，包含2×M5 SuperTaqDNA 聚合酶12.5 μL，上、下游引物各0.25 μL，DNA模板1 μL，用无菌双蒸水（ddH2O）补足剩余体积。初始反应程序：95 ℃预变性3 min，55 个循环（94 ℃变性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s），72 ℃终延伸5 min，15 ℃保温。PCR 反应结束后，取反应产物7 μL，点样于溴化乙锭（EB）染色的1.5%琼脂糖凝胶上，200 V 电压条件下电泳8～10 min，置SYNGENE凝胶成像系统观察。

分别考察退火温度、循环次数、DNA 模板量、Taq酶种类、Taq酶用量、PCR 仪型号等因素，确定最佳反应体系和反应参数，并使用最佳条件对紫河车饮片、干浸膏粉及配方颗粒样品进行PCR 鉴别，验证该体系是否能稳定、准确地鉴别紫河车样品及其混伪品。

3 结果与分析

3.1 DNA提取方法考察

将2.1 项下DNA 提取物进行PCR 扩增，发现Wizard®SV Genomic DNA Purification System 试剂盒提取后扩增效果最好，其提取的紫河车饮片、干浸膏粉及配方颗粒均能产生单一条带（图2）。

图2 紫河车DNA提取方法考察

3.2 PCR鉴别条件考察

分别对PCR 鉴别的关键影响因素退火温度、循环次数、DNA 模板质量浓度进行系统考察。结果显示，当退火温度为60 ℃，循环数为33 次，DNA 模板质量浓度100 mg·L-1时紫河车饮片、干浸膏粉、配方颗粒均可扩增获得约110 bp 单一特异性鉴别条带，其混伪品及阴性对照均无条带（图3）。Taq酶种类影响特异性鉴别结果，其中，2×M5 SuperTaqPCR 聚合酶效果最佳，紫河车、干浸膏粉及配方颗粒均有单一条带，见图4 A。不同型号PCR 扩增仪对结果影响较小，使用4 种不同PCR 扩增仪均能准确鉴别紫河车饮片、干浸膏粉及配方颗粒（图4 B）。

图3 退火温度、循环次数及DNA模板量对紫河车PCR鉴别结果的影响

图4 Taq酶种类和PCR仪对紫河车PCR鉴别结果的影响

3.3 方法适用性考察

使用筛选出的反应条件，对所采购的紫河车饮片、干浸膏粉、不同厂家的紫河车配方颗粒及猪、牛、羊混伪品进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，发现紫河车饮片、干浸膏粉及不同生产厂家的配方颗粒均产生约110 bp 的单一特异性条带，混伪品和空白对照无条带（图5）。

图5 紫河车PCR方法学适用性考察

4 结语

当前对紫河车的鉴定研究主要针对紫河车饮片，如孔朝辉[18]详细描述了紫河车的形态特征；张穗[19]通过对比正伪品胎盘组织的显微特征，发现紫河车的显微特征具有明显差异点，可用于鉴别其正伪品；靳维荣等[20]通过薄层色谱法建立了适用于紫河车真伪鉴别的理化鉴别方法；陈俊等[21]基于紫河车及其混伪品种间COⅠ序列差异，建立了紫河车及其混伪品的邻接树，结果表明，基于COⅠ序列的DNA 条形码可用于紫河车的真伪鉴别。而对于紫河车经加工处理后的制品，如提取物、配方颗粒等，仍缺少准确、简便、快速的鉴定方法。

本研究通过紫河车与其伪品的COⅠ序列比对，发现其特异性SNP 位点，并对直接影响鉴别特异性的PCR 退火温度、循环次数、DNA 模板质量浓度、Taq酶种类等核心因素进行考察，并依据最佳鉴别条件进行了系统的方法学适用性考察，建立了一种适用于紫河车、干浸膏粉及配方颗粒中药基原真伪鉴别的方法。在紫河车、干浸膏粉及配方颗粒样品中均能扩出约110 bp 的单一特异性鉴别条带，伪品羊胎盘、牛、猪均无条带。使用建立的特异性鉴别方法对不同厂家生产的紫河车配方颗粒进行检验，结果显示，28 批样品均能检出紫河车源性成分，表明本研究建立的紫河车特异性鉴别方法对配方颗粒具有适用性。