牛黄及代用品的红外指纹图谱鉴别研究△

胡晓茹，倪景华，孙磊，傅欣彤，党晓蕾，戴忠*，马双成*

1.中国食品药品检定研究院，北京 100050；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药物研究所，北京 100050；3.北京市药品检验所，北京 102206

牛黄始载于《神农本草经》，是牛科动物牛Bostaurus domesticusGmelin的干燥胆结石，是一种常用的名贵中药，其功效显著，被广泛应用于650多种中成药制剂中[1]。牛黄来源稀缺，为解决用药问题出现了人工牛黄、体外培育牛黄和培植牛黄3 种代用品。其中人工牛黄即参照天然牛黄的已知成分，以牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸和胆红素等配制而成。体外培育牛黄是以牛的新鲜胆汁作母液，加入去氧胆酸、胆酸和复核胆红素等制成。培植牛黄是在牛的活体胆囊中培植的干燥胆结石。目前培植牛黄已无企业生产。由于3 种代用品与牛黄之间价格差距较大，且成分相近，不易区分，故出现了混用、掺伪等问题，严重影响了牛黄药材市场稳定，所以有必要开展相应的研究工作，建立牛黄及其代用品的鉴别方法。

中药指纹图谱技术可以从整体上反映产品的质量，是目前中药质量控制的有效手段之一。目前中药指纹图谱研究主要借助于液相色谱、薄层色谱等色谱技术，具有反映信息丰富、结果易判断的特点。但是由于分析结果受到色谱分析条件和提取方法的制约，并不能反映样品的全部信息。红外光谱法能够对化合物分子中的化学键或者官能团进行表征，其在中药材研究中所获得的信息是研究样本中所有组成成分的化学键或者官能团的累加信息[2]。由于红外光谱法无需采用提取等前处理，所以其表征的信息更全面且检测快速。近年来，科研人员充分发挥了红外光谱法分析速度快、检测成本低、样品量少的优势，采用红外光谱法、二维相关红外光谱法对肉苁蓉、赤芍等中药品种进行了指纹图谱研究，结果表明，红外指纹图谱结合数学统计方法可以进行产地区分、真伪鉴别等中药质量控制的研究[3‑6]。本研究通过分析牛黄、体外培育牛黄、人工牛黄的红外光谱指纹图谱，结合数学多元统计的方法对数据进行聚类分析，从而达到对牛黄、人工牛黄和体外培育牛黄的鉴别。

1 材料

1.1 试药

牛黄对照药材（编号：cb12，批号：121328‑201302）购于中国食品药品检定研究院；牛黄及人工牛黄样品均为市售样品，牛黄14 批，编号分别为cb13～cb24、cb32、cb38，经中国食品药品检定研究院中药民族药检定所康帅副研究员鉴定为牛科动物牛Bostaurus domesticusGmelin 的干燥胆结石；人工牛黄11 批，编号分别为cb25～cb29、cb31、cb33～cb37；体外培育牛黄12 批，11 批购自武汉健民大鹏药业有限公司，编号分别为cb1～cb11，批号分别为121202、120401、120901、121101、130102、120601、120501、120702、121001、120801、120201，1 批为市售样品，编号为cb30；溴化钾（KBr）为光谱纯，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

Nicolet 5700 型傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Electron Corporation公司），分辨率为4 cm-1，扫描范围为4000～400 cm-1；XP2U 型百万分之一电子天平（瑞士Mettler‑Toledo 公司）；YP‑2 型压片机（上海山岳科学仪器公司）。

2 方法

2.1 样品处理及红外光谱测定

采用压片法，分别取牛黄、体外培育牛黄或人工牛黄约1 mg，加入KBr 约240 mg，放入研钵中充分研细。压片后置于红外光谱仪中测试，以KBr 为背景累积扫描64 次，每个样品平行测3 次，获得3 个光谱图，经OMNIC 7.3软件进行多点基线校正，除去基线影响。将数据另存为.CSV 格式导入软件ChemPattern（2017专业版）中进行相似度运算。

2.2 精密度试验

取同一份牛黄样品（cb18），按2.1 项下方法制备样品，连续进行5 次红外光谱采集，对采集的谱图进行分析。

2.3 重复性试验

取同一份牛黄样品（cb18），按2.1 项下方法平行制备5 份样品压片，进行红外光谱采集，分别测定1次，对采集的谱图进行分析。

2.4 稳定性试验

取同一份牛黄样品（cb18），按2.1 项下方法制备样品，每隔15 min 进行1 次光谱采集，连续测定5 次，对采集的谱图进行分析。

2.5 样品测定

对所收集的牛黄及代用品，按2.1 项下方法制备样品，进行红外光谱采集，对采集的谱图进行分析。

2.6 聚类分析

将数据另存为.CSV 格式导入ChemPattern 软件，采用近邻聚类法，利用平方欧式距离作为样品的测度，进行系统聚类分析。

2.7 主成分分析（PCA）

应用ChemPattern 软件对数据进行标度化处理，进行PCA。

3 结果与讨论

3.1 精密度试验

连续进行5 次检测所得红外谱图基本一致，相似度均值为0.99，表明仪器精密度良好。

3.2 重复性试验

5 份样品所得红外光谱图基本一致，相似度均值为0.99，表明样品重复性良好。

3.3 稳定性试验

同一份牛黄样品连续测定5 次，所得红外光谱图基本一致，相似度均值为0.99，表明样品在1 h内稳定。

3.4 样品测定

对所收集的牛黄及代用品进行红外光谱测定，结果见图1～3。红外光谱中1690～1600 cm-1是胆红素盐类及胆色素高聚物结构中酰胺基团的吸收信号，包括C=O 的伸缩振动和N‑H 的弯曲振动。1500～1400 cm-1可能是胆红素盐类中吡咯环骨架振动吸收信号和NH2（N‑H）的弯曲振动信号。1200、1050 cm-1为磺酸根的吸收信号[7‑8]。通过直观观察可发现，在1700～1500、1200～900、700～500 cm-1，人工牛黄与天然牛黄和体外培育牛黄有明显差异，可用于区别人工牛黄与天然牛黄和体外培育牛黄。天然牛黄与体外培育牛黄在红外光谱上的差异主要体现在1550、1450、1250 cm-1峰的强弱不同，可明显看出天然牛黄中对应的峰强度弱于体外培育牛黄，尤其是1550 cm-1可能主要体现的是NH2（N‑H）的信号，这与前期研究发现体外培育牛黄中牛磺酸含量远高于牛黄的结果一致[9]。

图1 牛黄的红外光谱

3.5 牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄红外光谱聚类分析

图2 人工牛黄的红外光谱

图3 体外培育牛黄的红外光谱

应用ChemPattern软件对样品的红外光谱数据进行系统聚类，结果见图4，牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄分别聚为一类。其中样品cb24 与体外培育牛黄聚为一类，通过对比样品cb24 的红外光谱可以发现，其在1550、1450、1250 cm-1峰的吸收强弱与其他体外培育牛黄样品相似度较高，而与天然牛黄存在明显差异，见图5。而样品cb24 的外观性状与天然牛黄相似，结合高效液相色谱指纹图谱分析结果，判断样品cb24 可能是以体外培育牛黄冒充天然牛黄。

图4 牛黄及代用品红外光谱图聚类分析

图5 样品cb24与cb2、cb12的红外光谱图对比

3.6 牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄红外光谱PCA

应用ChemPattern 软件对数据进行标度化处理，进行PCA。根据主成分PC1、PC2 和PC3 得分绘制三维散点图（图6），其中PC1、PC2 和PC3 之和为90.17%。由图6 可以看出，不同种类牛黄处于相对独立的空间，反映了不同种类牛黄之间化学组成存在差异。其中体外培育牛黄均为同一企业样品，分布较为集中，而天然牛黄来源于国内不同省份，差异较大。

图6 牛黄及代用品红外光谱PCA结果

4 结论

本研究分析了牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄的红外光谱指纹图谱，结果表明，牛黄及代用品的红外光谱信号存在差异，人工牛黄在1700～1500、1200～900、700～500 cm-1波数处的峰强弱与天然牛黄和体外培育牛黄存在明显差异，可用于区分人工牛黄；天然牛黄与体外培育牛黄在1550、1450、1250 cm-1波数处的峰强弱不同，天然牛黄中对应的峰强度明显弱于体外培育牛黄。采用聚类分析和PCA 等多元统计方法对红外光谱数据进行分析，结果显示，牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄的红外光谱数据均可分别聚为一类，表明红外光谱可用于牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄的鉴别研究，该方法为牛黄及其代用品的鉴别提供了新的方向。同时本研究发现，牛黄及代用品的红外光谱中的吸收峰对化学成分组成的变化较为灵敏。结合文献报道，可采用红外光谱法对复方制剂中各主要药味药效组分进行表征，达到中药复方质量控制的目的[10]。是否可在本研究基础上应用红外光谱开展牛黄制剂的表征，寻找不同牛黄投料制剂的红外光谱特征，进而开展牛黄制剂中牛黄种类的鉴别，有待进一步研究。