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敲减长链非编码RNA MIR4697HG抑制骨髓间充质干细胞成脂向分化

2022-04-11郭艳艳金婵媛

北京大学学报(医学版) 2022年2期
关键词:充质成骨分化

帅 婷,刘 娟,郭艳艳,金婵媛△

(1.北京大学口腔医学院·口腔医院第二门诊部,国家口腔医学中心,国家口腔疾病临床医学研究中心,口腔生物材料和数字诊疗装备国家工程研究中心,口腔数字医学北京市重点实验室,国家卫生健康委员会口腔医学计算机应用工程技术研究中心,国家药品监督管理局口腔生物材料重点实验室,北京 100081; 2.首都医科大学附属北京友谊医院口腔科,北京 100050)

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是一类来源于骨髓的多能干细胞,主要的生物学特点是自我更新和多向分化潜能,在特定条件下可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。在骨组织内部,BMSCs存在着成骨向、成脂向分化之间相互制约、相互转化的动态平衡,成骨-成脂肪平衡的打破将导致骨内的病理状况如骨质疏松症等骨病的发生[1],因此,成骨-成脂肪分化平衡对于维持骨内稳态至关重要。研究表明,成骨-成脂肪分化过程通常由多种转录因子和表观遗传因子共同调控,如过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARγ)、Runt 相关转录因子(runt-related transcription factor 2,RUNX2)。目前BMSCs成骨向分化的研究已受到较多学者的关注,而成脂向分化的研究对于理解BMSCs成骨-成脂分化失调以及治疗骨质疏松症(osteoporosis,OP)等骨稳态失调疾病同样重要。

随着高通量测序及分子生物学技术的进步,学者们逐渐发现长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)通过表观遗传调控、转录调控和转录后调控等方式在细胞生理性活动及疾病发生发展中发挥着重要作用[2]。近年来,研究显示lncRNA在间充质干细胞成脂向分化过程中也起着重要调控作用[3]。Luan等[4]研究发现脂肪基质细胞成脂分化前后,有2 868个基因表达水平发生变化,其中207个是非编码RNA。Liu等[5]研究者发现,lncRNATINCR通过TINCR/miR-31-5p/CEBP/α调控人脂肪间充质干细胞成脂向分化。

MIR4697宿主基因(MIR4697host gene,MIR4697HG),又称为LINC00947,位于11号染色体上。以往的报道显示,MIR4697HG与肿瘤的发生发展有密切关系。Mao等[6]研究发现MIR4697HG可以通过miR-766-5p调控胶质瘤的形成和进展。Zhang等[7]研究显示MIR4697HG可能通过细胞外调节蛋白激酶和蛋白激酶B信号通路促进卵巢癌细胞的增殖和转移,但MIR4697HG对BMSCs成脂向分化的影响目前还未见报道,因此,本研究旨在初步探究MIR4697HG对BMSCs成脂向分化的调控作用,为提高BMSCs成脂向分化能力,治疗成骨-成脂紊乱相关的骨类疾病提供新思路。

1 资料与方法

1.1 BMSCs的体外培养和成脂诱导

原代人BMSCs从美国Science Cell公司购买(货号:21580),本细胞出厂前经过厂家内部标志蛋白免疫荧光染色鉴定及分化能力检测,运输过程中采用干冰冻存。细胞传至第3代用于实验,细胞培养在含5%CO2(体积分数)的37 ℃恒温培养箱内。增殖培养基(proliferation medium,PM)包括改良Eagle培养基(Gibco公司,美国)、10%(体积分数)胎牛血清(Gibco公司,美国)、1%(质量分数)青-链霉素(Gibco公司,美国)。成脂诱导培养基(adipoge-nic medium,AM)是在PM中添加200 μmol/L吲哚美辛(Sigma-Aldrich公司,美国)、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Sigma-Aldrich公司,美国)、10 μmol/L胰岛素(Sigma-Aldrich公司,美国)和100 nmol/L地塞米松(Sigma-Aldrich,美国)。细胞每2 d换1次液,在AM中培养7或14 d后收集细胞,进行成脂验证实验,包括实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)、油红O染色及蛋白质印迹实验(Western blot), 所有细胞实验均重复3次以上。

1.2 qRT-PCR

根据TRIzol(Invitrogen公司,美国)说明书提取细胞的总RNA。通过PrimeScriptTMRT(Takara公司,日本)逆转录试剂盒合成cDNA,然后根据SYBR Green Master Mix(Roche Applied Science公司,德国)的说明书,通过ABI Prism 7500实时PCR(Applied Biosystems公司,美国)进行qRT-PCR。qRT-PCR反应结束后,确定各基因的扩增循环数(cycle threshold,Ct)值,并以内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的表达水平为参照物,评估目的基因的相对表达量,结果使用ΔΔCt法分析。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primer sequences used for qRT-PCR

1.3 慢病毒感染BMSCs

设计3组慢病毒序列,分别为MIR4697HG敲减序列1(shMIR4697HG-1)、MIR4697HG敲减序列2(shMIR4697HG-2)及其对照(shNC,表2),慢病毒MIR4697HG敲减载体由上海吉玛制药技术有限公司合成。

取第3代的BMSCs进行实验,将细胞接种至培养皿中,待细胞长满50%时进行慢病毒感染,根据感染说明书其感染复数(感染时病毒与细胞数量的比值)为50,慢病毒滴度为3×107TU/mL;为促进感染效率,加入5 mg/L聚凝胺,感染24 h后更换新鲜培养基继续培养。根据病毒转染情况,分为3组:(1)阴性对照组(shNC组):感染无序列质粒载体慢病毒的BMSCs;(2)实验组1:感染shMIR4697HG-1慢病毒的BMSCs(shMIR4697HG-1组);(3)实验组2:感染shMIR4697HG-2慢病毒的BMSCs(shMIR4697HG-2组)。由于慢病毒携带的质粒载体可以表达绿色荧光蛋白及嘌呤霉素抗性基因,因此72 h后通过使用1~5 mg/L嘌呤霉素筛选稳转的BMSCs,并通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况。

表2 shRNA 靶序列Table 2 shRNA sequences of lentiviruses

1.4 Western blot

细胞培养皿去掉培养基,用预冷磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)冲洗3次,加入适量的放射免疫沉淀测定(radioimmune precipitation assay,RIPA)裂解液及蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)提取细胞总蛋白。通过二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)定量检测试剂盒(Thermo公司,美国)测量蛋白浓度。通过计算取30 μg蛋白,加入5×上样缓冲液,将样品配成30 μL的蛋白上样体系,电泳分离蛋白,在100 V恒压冷室转膜90 min,用5%(质量分数)脱脂牛奶封闭,聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜加一抗PPARγ(Cell Signaling Technology公司,美国)、CEBP/α(Cell Signaling Technology公司,美国),置于4 ℃冷室摇床上过夜孵育;在PVDF膜中加入对应的二抗(Cell Signaling Technology公司,美国),室温条件下孵育1 h,采用超敏ECL发光液(康为世纪公司,中国)孵育,在化学显影机器曝光记录条带。

1.5 油红O染色

BMSCs接种于12孔板,培养14 d后用PBS清洗3次,用10%(质量分数)甲醛固定30 min。然后用60%(体积分数)异丙醇润洗细胞。加入油红O溶液(Sigma-Aldrich公司,美国),室温孵育10 min,弃去染液,显微镜下观察和成像。染色细胞用100%(体积分数)异丙醇洗脱,用于定量评价。100%(体积分数)异丙醇为空白对照,在500 nm波长下测量光密度值。

1.6 统计学分析

所有统计分析由PRISM软件进行,数据用均数±标准差表示。两组比较使用双侧独立样本t检验,多组比较使用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MIR4697HG在BMSC成脂肪分化中上调

在BMSCs成脂诱导的0、1、2、3、5、7、10 d分别收集细胞提取RNA进行qRT-PCR实验,结果显示与成脂诱导的0 d相比,MIR4697HG同成脂肪相关基因PPARγ、CEBP/α和ADIPQ的表达趋势相似,随着成脂诱导时间的延长逐渐增加(P<0.01,图1)。

BMSCs, bone marrow mesenchymal stem cells; The other abbreviations as in Table 1.* P<0.05, vs. 0 d; A, the expression level of MIR4697HG after 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10 days of adipogenic induction in BMSCs; B, the expression level of PPARγ after 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10 days of adipogenic induction in BMSCs; C, the expression level of CEBP/α after 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10 days of adipogenic induction in BMSCs; D, the expression level of ADIPQ after 0, 1, 2, 3, 5, 7, 10 days of adipogenic induction in BMSCs.图1 BMSCs成脂诱导后MIR4697HG和成脂相关基因的表达水平Figure 1 Expression level of MIR4697HG and adipogenesis-related genes after adipogenic induction in BMSCs

2.2 构建MIR4697HG敲减的BMSCs细胞系

为防止脱靶效应,本研究使用了两条不同序列的shRNA(shMIR4697HG-1,shMIR4697HG-2)。慢病毒感染BMSCs 72 h后,荧光显微镜下可以观察到90%以上细胞成功表达绿色荧光蛋白(图2A),qRT-PCR进一步证实MIR4697HG敲减效率高于60%(图2B)。

2.3 敲减MIR4697HG抑制BMSCs成脂向分化

在MIR4697HG敲减细胞及其对照细胞(shNC)成脂诱导7 d后提取RNA进行qRT-PCR实验,结果显示敲低MIR4697HG后,成脂相关基因PPARγ、CEBP/α和ADIPQ的mRNA水平显著降低(图3A)。Western blot结果同样显示PPARγ、CEBP/α的蛋白表达水平在MIR4697HG敲减BMSCs中显著降低(图3B)。油红O染色实验显示,成脂诱导14 d时,敲减MIR4697HG的细胞所形成的红色脂滴较shNC细胞明显减少,油红O染色定量结果同样证明敲减MIR4697HG后细胞成脂能力下降(图3C)。

GFP, green fluorescent protein;MIR4697HG, MIR4697 host gene.*P<0.05; vs. shNC group; A, the transfection effect was observed by fluorescence microscopy 24 hours after shMIR4697HG-1 group, shMIR4697HG-2 group and shNC group transfection;B, the transfection efficiency of MIR4697HG was examined by qRT-PCR.图2 慢病毒感染效果和敲减效率检测Figure 2 Examination of lentivirus transfection effect and efficiency

3 讨论

随着老龄化社会的到来,OP的发病率逐年上升[8]。OP是以骨量减少,骨组织微细结构破坏导致骨脆性增加的一种系统性全身性骨骼疾病。目前治疗OP的药物主要分为3类,包括促进成骨细胞(如双磷酸盐类、雌激素及其受体调节剂类等)、抑制破骨细胞(如特立帕肽、阿巴帕肽等)和双向作用药物(促进成骨细胞同时抑制破骨细胞,如罗莫索单抗、雷尼酸锶等), 但这些药物副作用较大,治疗效果有限,给患者的身心及社会带来较大的负担[9]。

BMSCs是一类从骨髓中分离提取的成体干细胞,其在骨内可以向成骨细胞和脂肪细胞分化。正常的骨组织内,骨髓间充质干细胞在成骨及成脂向分化时存在着一定的平衡关系。当BMSCs成骨向分化减少,成脂向分化增多时,可引起OP等疾病的进展。目前研究发现多种信号通路参与了BMSCs的成骨/成脂分化过程,包括Wnt/β-catenin[10]、RANKL/RANK[11-12]、TGFβ/Smad[13]、ERK[14]、NF-κB和MAPK[15]等。然而BMSCs成骨/成脂分化过程复杂,是一个多步骤、多基因、多因素的过程,是否受到特定关键分子或信号通路的调控尚不清楚,目前仍有很多未知的分子机制[16-17],因此,探索BMSCs的成骨/成脂向分化的机制对于预防和治疗骨质疏松等疾病具有重要的指导意义。

近年来研究发现多种lncRNA在间充质干细胞成骨分化及成脂向分化中起到不同的调控作用[18-20]。部分研究指出lncRNA促进BMSCs成骨向分化,lncRNATCONS_00041960作为miR-204-5p和miR-125a-3p的竞争性内源性RNA参与调控BMSCs的成骨/成脂分化平衡[18]。TCONS_00041960过表达促进RUNX2、osterix等成骨基因的表达,而抑制成脂相关基因的表达[18]。也有研究指出lncRNAH19作为miR-188海绵,调节LCOR表达,进而参与调控小鼠骨髓间充质干细胞(mouse bone marrow mesenchymal stem cells,mBMSCs)成骨和成脂向分化[19],而有些研究则发现部分lncRNA促进BMSCs成脂向分化,如lncRNAORLNC1作为miR-296的竞争性内源RNA,抑制BMSCs成骨向分化,促进BMSCs成脂向分化,ORLNC1在卵巢切除术诱导骨质疏松症小鼠的血液及骨质疏松症患者的骨组织中表达显著增加[20]。另一项研究显示,在小鼠体内抑制lncRNAPPARγ辅活化子-1β-OT1将促进骨组织内脂肪堆积,抑制成骨细胞分化[21]。

本研究显示lncRNAMIR4697HG在BMSCs成脂分化中明显增加,敲减能够抑制BMSCs表达PPARγ和CEBP/α,这在一定程度上阐释了OP等成脂肪异常疾病的发病机制并为制定治疗策略提供了一定的理论基础,但是更为详细的分子机制仍需进一步研究。

PM, proliferation medium; AM, adipogenic medium; BMSCs, bone marrow mesenchymal stem cells; The other abbreviations as in Table 1; *P<0.05; vs. shNC group; A, qRT-PCR results after adipogenic induction in MIR4697HG-knockdown BMSCs; B, Western blot results after adipogenic induction in MIR4697HG-knockdown BMSCs; C, oil red staining results after adipogenic induction in MIR4697HG-knockdown BMSCs.图3 敲减MIR4697HG抑制BMSCs成脂分化的检测结果Figure 3 Results after adipogenic induction in MIR4697HG-knockdown BMSCs

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