乙型肝炎病毒在不同丙氨酸氨基转移酶状态下对Th17、Treg细胞及其比率的影响

高 鹏，雒艳萍，李俊峰△，陈 琳，毛小荣

(1. 兰州大学第一医院传染病研究室，2. 兰州大学基础医学院免疫教研室，3. 兰州大学第一医院传染科， 兰州 730000)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染人体后主要通过机体对病毒的免疫应答而导致肝细胞的损害。以T淋巴细胞为主的细胞免疫应答功能紊乱在乙型肝炎发生、发展中具有关键性的作用，辅助性T淋巴细胞17 (helper T lymphocytes 17, Th17)、调节性T淋巴细胞 (regulatory T lymphocyte, Treg)的变化是这一研究中的热点之一。同时HBV感染人体后可处于不同免疫状态，临床上经常以丙氨酸氨基转移酶(alanine aminetransferase, ALT)结合其他指标加以分析判断，并作出相应的治疗计划，但是目前鲜见有文献以ALT为节点判断在不同免疫状态下HBV对慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者Th17、Treg细胞及其比率的影响，本文就此加以研究分析。

1 资料与方法

1.1 资料

分析2017年1月至2018年12月在兰州大学第一医院确诊为CHB患者336例，其中男268例，女68例，年龄18～60岁，所选患者病例完整。经临床和实验数据分析后，其中ALT正常的CHB患者111例 (ALT<40 U/L)，ALT≥正常上限且<2倍增高的慢性乙肝患者108例 (40 U/L≤ALT<80 U/L)，ALT≥正常上限2倍增高的CHB患者117例(80 U/L≤ALT),并且按病毒载量分为低复制组(HBV DNA<4.0 lg copies/mL)、中复制组(4.0 lg copies/mL≤HBV DNA<6.0 lg copies/mL)和高复制组(HBV DNA≥6.0 lg copies/mL)。分别观察在不同组别中不同载量的HBV对Th17、Treg细胞及其比率的影响。同时对ALT≥正常上限2倍增高的CHB患者给予恩替卡韦(entecavir, 0.5 mg/d)治疗，随访24周，观察抗病毒前后患者Th17、Treg细胞频率及其比率的的变化。CHB的诊断标准符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》的诊断标准[1]。同时排除妊娠期妇女，中、重度脂肪肝患者，酒精肝患者，药物性肝损伤患者，自身免疫性肝损伤患者，曾经接受过抗病毒治疗的患者，以及合并其他肝炎感染的患者，及并发其他心血管、肾脏等重大脏器病变患者。

1.2 仪器

荧光定量PCR分析仪购自德国 Lightcycler ROCH公司，流式细胞仪(FACS Calibur)及配套试剂购自美国BD公司，AU400型全自动生化分析仪购自日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1HBV定量检测 采集患者静脉血并分离血清，按罗氏 Cobas e 601 化学发光免疫分析仪(罗氏公司，瑞士)的操作步骤进行定标及样本检测。

1.3.2HBV DNA检测 采集患者静脉血并分离血清，按HBV DNA 定量检测试剂盒和基因扩增仪的操作步骤进行检测，敏感度>500 copies/mL。

1.3.3外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) 的分离及培养 采集研究对象外周血，肝素抗凝，以磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline, PBS)等体积稀释后，应用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离出外周血PBMC，用含 10%(体积分数)标准胎牛血清的 RPMI1640 培养液重悬细胞得到 1×106个/mL。向 PBMC 悬液加入佛波酯 (12.5 mg /L)、离子霉素(0.25 g /L)、布雷菲德霉素 A(0.75 g /L)、莫能霉素(0.35 g /L) 后于 37.0 ℃、5%(体积分数)CO2培养箱中放置并培养 4 h。

1.3.4外周血 Th17 细胞检测 取培养后的细胞悬液100 μL，加入 CD3抗体 10 μL 和CD8 抗体 10 μL 进行细胞表面染色，于 4 ℃避光孵育 30 min。加300 μL PBS 洗涤，混匀低速离心 5 min(1 500 r/min)后弃上清液，然后加入100 μL固定液固定洗涤，于 4 ℃避光孵育30 min，然后加入300 μL PBS，混匀低速离心 5 min(1 500 r/min)弃上清液，再加入100 μL 破膜液进行破膜洗涤，然后加入白细胞介素(interleukin, IL)-17抗体10 μL 进行细胞内染色，于 4 ℃避光孵育30 min，加入300 μL PBS 洗涤，混匀低速离心 5 min(1 500 r/min)后弃上清液，最后加入PBS 300 μL 混匀细胞，用流式细胞仪对 CD3+CD8-IL-17+T 细胞进行检测。

1.3.5外周血 Treg 细胞检测 取培养后的细胞悬液100 μL，加入CD4 抗体 10 μL 和 CD25抗体 10 μL，进行细胞表面染色，于 4 ℃避光孵育 30 min 后，加300 μL PBS 洗涤，混匀低速离心 5 min(1 500 r/min)后弃上清液，加100 μL固定液固定洗涤，于 4 ℃避光孵育 30 min 后接着加入300 μL PBS，混匀低速离心 5 min(1 500 r/min)后弃上清液，再加入100 μL破膜液进行破膜洗涤，加入 Foxp3 抗体 10 μL进行细胞内染色，于 4 ℃避光孵育30 min，加入300 μL PBS 洗涤，混匀低速离心 5 min(1 500 r/min)后弃上清液，最后加入PBS 300 μL混匀细胞，用流式细胞仪对 CD4+CD25+Foxp3+T 细胞进行检测。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间均数比较采用Dunnett T3方差分析进行处理，配对资料的分析采用配对t检验分析，采用双侧检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALT正常的CHB患者中HBV对Th17、Treg细胞及其比率的影响

对于ALT正常的CHB患者，HBV载量高低对Th17、Treg细胞及其比率无明显影响，详见表1。

2.2 ALT≥正常上限且<2倍增高的CHB患者中HBV对Th17、Treg细胞及其比率的影响

对于ALT≥正常上限且<2倍增高的CHB患者，HBV载量高低对Th17、Treg细胞及其比率无明显影响，详见表2。

表1 ALT正常组不同病毒载量CHB患者Th17、Treg细胞及其比率(n=111)Table 1 Th17, Treg cells and their ratio in CHB patients with different viral load in normal ALT group (n = 111)

表2 ALT≥正常上限且<2倍增高的CHB不同病毒载量组中Th17、Treg细胞及其比率的方差分析(n=108)Table 2 Variance analysis of Th17, Treg cells and their ratio in CHB with ALT ≥ the upper limit of normal and < 2 times increase in different viral load groups (n = 108)

2.3 ALT≥正常上限2倍的CHB患者中HBV对Th17、Treg细胞及其比率的影响

对于ALT≥正常上限2倍增高的CHB患者，随着病毒载量的增加，Th17细胞频率明显增高，Treg细胞频率明显增高，Th17/ Treg细胞比率亦明显增高，差异均有统计学意义(P<0.001)，详见表3。

表3 ALT≥正常上限2倍增高的CHB患者不同病毒载量组中Th17、Treg细胞及其比率的方差分析(n=117)Table 3 Variance analysis of Th17, Treg cells and their ratio in different viral load groups in CHB patients with ALT≥2 times higher than the upper limit of normal (n = 117)

2.4 117例ALT≥正常上限2倍的CHB患者恩替卡韦抗病毒治疗前后病毒学、血清学指标变化

对于ALT≥正常上限2倍的117例CHB患者采用恩替卡韦(0.5 mg/d)抗病毒治疗，治疗前后病毒学、血清学指标变化进行配对t检验，结果表明HBV DNA明显下降，由(6.37±1.86) lg copies/mL下降为(3.56±1.12) lg copies/mL (t=15.628)。HBsAg由4.38±1.87下降为2.57±1.01 (t=16.849)。HBeAg由4.02±1.75下降为2.32±0.84 (t=14.521)， 差异均具有统计学意义(P<0.001)。85例患者发生HBV DNA完全应答，完全应答率为72.65%，20例患者发生部分应答，部分应答率为17.09%，12例患者未发生应答，无应答率为10.25%。8例患者发生HBeAg血清学转换(8/39), HBeAg血清学转换率为20.51%，有1例患者发生HBsAg的阴转，阴转率为0.85%。

2.5 117例ALT≥正常上限2倍的CHB患者恩替卡韦抗病毒治疗前后Th17、Treg细胞及其比率的变化

对于ALT≥正常上限2倍增高的117例慢性乙肝患者采用恩替卡韦(0.5 mg/d)抗病毒治疗，治疗前后Th17、Treg细胞及其比率的变化进行配对t检验，结果见表4。相对于治疗前，Th17、Treg细胞频率及Th17/Treg细胞比率均明显下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表4 117例ALT高于正常上限2倍的CHB患者恩替卡韦治疗前后Th17、Treg细胞及其比率的变化 (n = 117)Table 4 Changes of Th17, Treg cells and their ratios before and after entecavir treatment in CHB patients with ALT≥2 times higher than the upper limit of normal (n = 117)

3 讨论

患者感染HBV后，可处于不同的免疫状态，即免疫应答期和免疫耐受期[2]。根据ALT的正常与否，结合临床症状和体征，将HBV感染者分为HBV携带者和乙型肝炎患者[3]。ALT在HBV携带者中通常正常或轻微增高，而在CHB患者中常出现2倍以上的增高。临床上依据ALT并结合临床症状与体征对不同阶段的乙型肝炎感染者采取不同的临床治疗手段，对HBV携带者密切观察，而对乙型肝炎患者则积极进行抗病毒治疗[4]。病理性免疫反应是乙型肝炎发生发展的重要环节，特别是以T淋巴细胞为主的细胞免疫机制紊乱在乙型肝炎的发病环节中处于重要地位[5]，近年来研究发现，T淋巴细胞亚群Th17、Treg细胞及其比率与乙型肝炎的发生发展有着密切的联系[6-8]。Th17细胞作为一种典型的促炎细胞，通过分泌IL-17等炎性因子，集聚中性粒细胞促进炎性反应，参与到肝脏的损伤过程以及HBV的清除[9-10]，而Treg细胞主要通过调节自身T淋巴细胞，分泌抗炎性因子，如IL-10、转化生长因子-β等抑制CD4+、CD8+T 细胞、自然杀伤细胞、B细胞和树突状细胞，维持自身免疫耐受[11-12]。同时研究发现Th17/Treg值与肝损伤程度呈正相关，Th17/Treg在介导抗病毒治疗的免疫应答中起重要作用[13]，但是目前少有以ALT分组探讨在不同ALT状态下，Th17、Treg及其比值与HBV载量高低的相互关系以及对机体免疫功能影响的报道。

本研究中显示，在ALT正常组和≥正常上限、且小于2倍增高的CHB组中，不同载量的HBV对Th17、Treg细胞及其比率的影响甚微，差异无统计学意义，提示机体大多处于免疫耐受状态，HBV与机体互相适应，互不干涉，未能引起机体强烈的病理性免疫反应。机体的T、B淋巴细胞等免疫细胞未对HBV的入侵作出强烈的免疫反应，机体肝功能指标大多正常或轻微增高，肝损伤、炎症不显著[14]。本研究中，HBV载量的高低不同对Th17、Treg细胞及其比率差异无统计学意义，同时对这个阶段的患者需密切观察，定期复查，而不采用抗病毒治疗。

对于ALT≥正常上限2倍增高的CHB而言，本研究显示，随着病毒载量的增加，Th17、Treg细胞及其比率均明显增高。在此阶段，机体大多处于免疫应答阶段，机体的T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞大多被激活，与HBV进行着抗争，随着病毒载量的增加，这种病理性的免疫反应愈强烈，肝的炎症反应愈强烈，损伤愈大，肝功能指标大多异常[15]。同样的情况也反映在Th17、Treg细胞及其比率上，随着病毒载量的增加，Th17细胞明显增加。Th17细胞主要分泌IL-17，具有促进炎症反应的作用[16]。在HBV感染患者中，促进炎症反应及肝细胞损伤，随着病毒载量的增加，Th17细胞也随之增加，机体的炎症反应更加强烈，机体加大清除HBV的力度，同时机体的损伤也更加明显。在此阶段，随着病毒载量的增加，Treg细胞也逐渐增加，Treg细胞是一种免疫抑制细胞，与Th17细胞相辅相成，共同调节着机体的免疫机制[17]。随着病毒载量的增加，Th17细胞数量增加，机体的病理性免疫反应增强，机体为了调控这一病理性免疫反应机制，Treg细胞也随之增加，而使得病理性免疫反应得以控制，不至于过于强烈，而对于Th17/Treg细胞比率而言，有研究显示，Th17/Treg细胞比率与肝损伤程度呈正相关，Th17/Treg 的失衡加重肝损伤，修复 Th17/Treg 平衡对 HBV 感染相关肝病可能是一种新的免疫疗法[18-20]。在本研究中，对于ALT≥正常上限2倍增高的CHB患者，随着病毒载量的增加，Th17/Treg细胞比率也同样随之增高，反映Th17这一炎性细胞的增长速度明显高于Treg细胞这一抑制炎性反应细胞的增长速度，表明随着病毒载量的增加，机体促进炎性反应的因素明显高于抑制作用，机体抗病毒反应明显增强，同时炎症损伤也增大。

本研究对ALT≥正常上限2倍的CHB患者采用恩替卡韦抗病毒治疗，并随访24周，其血清学及免疫学指标显示，恩替卡韦治疗24周后，患者HBV DNA明显下降。ALT≥正常上限2倍增高是抗病毒治疗的适应证之一，这是肝病界医生公认的指证。恩替卡韦是目前CHB患者治疗的一线用药，也是国内外指南推荐的首选核苷类抗病毒药物，本研究中对这类患者积极进行恩替卡韦抗病毒治疗，病毒学指标和免疫学指标均取得了很好的改善。由本研究可见，随着病毒载量的下降，Th17和Treg细胞频率明显下降，反映出随着机体炎症反应的减弱，机体平衡炎症反应的能力也随之减轻，而Th17/Treg细胞比率也随之降低，反映机体炎症反应趋缓，建立了新的免疫平衡。

综上所述，在不同的ALT状态下，HBV载量高低对机体Th17、Treg细胞及其比率的影响是不同的，可以从免疫学的角度出发，进一步深入探讨临床上以ALT分组治疗患者的科学意义。