荷载JQ1/紫杉醇 PLGA纳米粒的制备

刘骞，王沐芳，侯哲，王韶鸿，王慎兴，王鹏，刘芷萱，赵静, 郝吉福*

(1.山东第一医科大学(山东省医学科学院)药学院，山东 泰安 271016；2.山东省泰山疗养院(山东省泰山医院)，山东 泰安 271016)

近年来针对肿瘤开展的免疫治疗倍受关注，但肿瘤细胞表面的程序性死亡配体1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)会与细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)上程序性死亡受体1(programmed cell death receptor 1，PD-1)相互结合，耗竭CTL的功能，产生免疫逃逸，降低其对肿瘤的杀伤作用[1-2]。JQ1作为溴结构域蛋白(bromodomain containing protein 4，BRD4)的有效抑制剂，能够降低PD-L1在肿瘤细胞表面的表达，解除肿瘤细胞对CTL的免疫抑制[3-5]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)作为一线抗肿瘤药物，其疗效在肺癌、乳腺癌等临床治疗中得到证实。因此，本文提出联合应用两种药物，一方面通过PTX杀伤肿瘤细胞释放肿瘤抗原激活抗肿瘤免疫反应，另一方面利用JQ1降低肿瘤细胞表面PD-L1的表达解除免疫抑制，共同发挥抗肿瘤的免疫治疗。然而，由于JQ1和PTX水溶性差，难以制成注射剂而限制了其应用。纳米制剂在改善难溶性药物的溶解性，实现系统递药和提高生物利用度方面发挥着重要作用[6-7]。本研究拟以高分子聚合物材料聚乳酸(PLA)-羟基乙酸(PGA)共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)为载体，将PTX和JQ1荷载于PLGA纳米粒中，实现两种药物的共同递送，以期发挥协同抗肿瘤作用。

1 仪器和材料

1.1 仪器

JY92-Ⅱ探头式超声波粉碎仪(宁波新芝生物科技股份有限公司)；K30超速离心机(德国Sigma公司)；Mastersizer 3000激光粒度分析仪(英国马尔文公司)；VP-10A plus高效液色谱仪(日本岛津公司)；FDU-1200台式冷冻干燥机(日本东京理化株式会社)；流式细胞仪(美国BD公司)。

1.2 药品和试剂

1.3 动物

雄性SD大鼠，体重(230 g±20 g)，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，合格证号SCXY(鲁)20140007。

2 方法和结果

2.1 荷载PTX/JQ1的PLGA纳米粒的制备

采用超声乳化溶剂蒸发法制备荷载PTX/JQ1的PLGA纳米粒[8-9]。精密称取10 mg PTX、5 mg JQ1与 200 mg PLGA，将三者溶于4.5 mL乙酸乙酯中，形成有机相(作为油相); 精密量取含有2.5 mg/mL的PVA水溶液20.0 mL作为水相，将油相与水相混合后，置于探头式超声波粉碎仪中，维持功率400 W条件下进行超声3 min，使形成外观均匀的乳浊液。将该乳浊液置于磁力搅拌器中不断搅拌，以除去有机溶剂。随后将所得到的纳米混悬剂进行超速离心15 min(12 000 r/min)，弃去含有游离药物的上清液后将沉淀物用蒸馏水分散，洗涤两次，同法离心收集沉淀，制备成荷载PTX/JQ1 的PLGA纳米粒，经冷冻干燥后备用。

2.2 PLGA纳米粒的粒径测定及形貌观察

取0.5 mL所制备的荷载PTX/JQ1 的PLGA纳米粒混悬液，采用激光粒度分析仪测定粒度和多分散指数(polydispersion index, PDI)；另将所制备的PLGA纳米粒适度稀释，滴加在覆盖有碳膜的铜网上，干燥后以2%磷钨钼酸进行负染制样，采用透射电镜观察其外观形貌。所测定的PLGA纳米粒粒径结果如图1(a)所示，其粒径呈单峰正态分布，平均粒径大小为210 nm左右，PDI为0.153(<0.3)，提示分散性良好，粒径大小较为均匀。由透射电镜结果图1(b)可以看出，所制备的PLGA纳米粒外观呈圆整、规则的球状结构，表面无黏连。

图1 荷载PTX/JQ1 的PLGA纳米粒粒径及透射电镜图

2.3 荷载PTX/JQ1的PLGA纳米粒的包封率及载药量测定

所测得的PTX的标准曲线方程为：A=26 956C-5 078(r=0.999 9)，表明PTX在0.5～25.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好；JQ1的标准曲线方程为：A=37 982C-13 470(r=0.999 2)，表明 JQ1在1.25～25.00 μg/mL浓度范围内线性关系良好。由标准曲线及所测得的峰面积分别计算PTX和JQ1在冻干粉中的含量，作为PLGA纳米粒中被包载的药物量M包载。另根据处方中所投药量M总量及所用PLGA的重量MPLGA，分别按公式(1)计算包封率(entrapment efficiency，pEE)与载药量(drug loading，qDL)。

(1)

经式(1)计算，可知PLGA纳米粒中PTX的包封率及载药量分别为(70.77±5.65)%，(6.43±0.51)%，(n=3)；JQ1的包封率及载药量分别为(57.3±4.31)%，(5.21±0.27)%，(n=3)。

2.4 荷载PTX/JQ1的PLGA纳米粒大鼠体内药动学分析

2.4.1 给药方法及血样处理

取体重230 g左右的SD大鼠6只，给药前一晚撤去饲料，禁食 12 h 以上，保持自由饮水。尾静脉注射所制备的荷载PTX/JQ1的PLGA纳米粒混悬液，给药剂量为4 mg/kg，分别在给药后0.08、0.25、0.5、1、2、4、6、8 h于眼内眦处取血约0.3 mL，置肝素化离心管中，3 000 r/min离心 10 min，分取血浆。精密吸取血浆100 μL，转移至1.5 mL离心管中，精密加入色谱纯乙腈300 μL，涡旋混合3 min，12 000 r/min高速离心10 min，吸取上清液20 μL，采用高效液相色谱(HPLC)法测定PTX和JQ1的含量。

2.4.2 血浆样品中PTX和JQ1含量测定方法

高效液相色谱条件同2.3项下PTX和JQ1测定方法。分别取实验大鼠的空白及含药血浆各 100 μL，按2.4.1项下血浆样品处理方法进行处理后，进行方法专属性考察。结果表明血浆中的内源性物质不干扰PTX和JQ1的测定，PTX和JQ1色谱峰的保留时间分别为6.5 min及14.5 min，结果见图2。

图2 血浆样品中PTX和JQ1的HPLC谱图

2.4.3 药时曲线与数据处理

将所测血浆样品的峰面积代入标准曲线方程，计算不同时间点的血药浓度，绘制药时曲线，结果见图3。将所测得的药时数据经DAS(drug and statistics)药动学软件进行隔室模型拟合处理，以拟合度、AIC(Akaike′s information criterion)确定合适的模型。拟合的药时曲线方程为：

图3 大鼠尾静脉注射PLGA纳米粒后PTX与JQ1血药浓度-时间曲线(n=6)

CPTX=7.26e-4.85t+0.87e-0.13t,

(2)

CJQ1=2.04e-4.07t+0.96e-0.29t。

(3)

测得PTX与JQ1主要的药动学参数如下：分布相半衰期(t1/2α)为0.142 8、0.169 9 h，消除相半衰期(t1/2β)为5.27、2.37 h，血药浓度曲线下面积(AUC)为8.155、3.793(μg·h)/mL，清除率(CL)为122.612、131.795 mL/(h·kg)，表观分布体积(V)为766.07、396.25 mL/kg。

2.5 对B16黑色素瘤细胞PD-L1的影响

2.5.1 细胞接种

取对数生长期的B16细胞，经胰酶消化后，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，收集细胞，以体积分数10%胎牛血清的1640培养基制成细胞悬液，计数后以1×104个/孔的数目接种到无菌24孔板中，每孔添加1 mL含血清培养基，置于37 ℃细胞培养箱培养，至单层细胞覆盖率到达70%～80% 时，进行加药共培养。

2.5.2 给药方案

实验分组共分为六组：①为对照组(记为Untreated)；②为0.5 μg/mL 的JQ1混悬液组(记为JQ1-S 0.5)：称取2.0 mg JQ1溶解在少量(<0.1 %)DMSO中，用培养基稀释成浓度为0.5 μg/mL，加入培养孔中与细胞共培养；③为0.25 μg/mL的JQ1混悬液组(记为JQ1-S 0.25)；④为0.5 μg/mL 的PLGA纳米粒组(记为JQ1-P 0.5)：取制备的荷载PTX/JQ1的PLGA纳米粒冻干粉分散在培养基中，再稀释至浓度为0.5 μg/mL，加入培养板中与细胞共培养；⑤为0.25 μg/mL的PLGA纳米粒组(记为JQ1-P 0.25)。细胞添加含药培养基后共培养72 h，期间间隔36 h换液一次。

2.5.3 细胞染色与检测

将培养72 h后的细胞弃去上层培养基，洗涤、消化、离心收集细胞。转移至96孔板中，加入封闭液封闭。随后加入50 μL配制好的表面抗体CD274-PE，混合均匀，4 ℃避光染色15 min，离心、洗涤除去多余抗体染液，最后加入A430进行染色。将染色完成的细胞进行流式细胞术分析，数据结果采用FlowJo软件进行处理，分析策略及PD-L1的抑制情况见图4。

B16细胞表面存在的PD-L1蛋白也被称为表面抗原分化簇274(CD274)。由图4(b)可知对照组CD274表达量最高，表明肿瘤细胞表面存在着PD-L1的表达；但经JQ1和PLGA纳米粒组处理后，均可降低B16黑色素瘤细胞表面PD-L1的表达，然而在同等浓度条件下JQ1与PLGA纳米粒组对肿瘤细胞表面PD-L1的影响没有统计学差异，表明将JQ1制备成纳米粒后，不影响JQ1的活性，仍能抑制PD-L1的表达。但在不同浓度下对抑制PD-L1表达情况存在着量效关系，有统计学差异(P<0.001)。

图4 荷载PTX/JQ1的PLGA纳米粒对PD-L1抑制情况

3 讨论

本实验采用可生物降解高分子材料PLGA，构建了共荷载PTX/JQ1的PLGA纳米粒递送系统，利用PTX的化疗作用诱导肿瘤细胞死亡释放抗原，结合免疫检查点抑制剂JQ1增强抗肿瘤免疫效应，以期改善模型药物PTX/JQ1难溶性及解决两者合用共递送的制剂问题。利用载体材料PLGA溶于有机溶剂不溶于水的特征，与模型药物共溶于有机溶剂后，分散到含有乳化剂的水相中，形成乳浊液，通过蒸发去除有机溶剂，使药物与载体材料溶解度降低析出固体，从而形成骨架型PLGA纳米粒递送系统。前期研究表明通过改变处方中载体材料PLGA及乳化剂的浓度，以及超声功率、超声时间等制备工艺可以控制纳米粒的粒度大小[10-11]。因此，所制备的PLGA纳米粒可以作为两种药物共递送的传输载体。

由于所制备PLGA纳米粒的平均粒径为210 nm，符合静脉注射给药的要求，纳米粒进入体循环后，依靠渗透滞留增强的EPR效应到达肿瘤部位，随后PLGA纳米粒降解释放药物发挥治疗作用[12]。在药动学研究中，利用DAS药动学软件按照不同隔室进行模型拟合，发现二室模型的 AIC 值最小，提示经尾静脉注射荷载PTX/JQ1的PLGA纳米粒后，药物在大鼠体内动力学特征符合二室模型。

在肿瘤的发生与进展过程中，肿瘤细胞表面蛋白PD-L1能与T细胞表面的PD-1结合，产生抑制信号，耗竭T细胞正常功能，进而产生免疫逃逸。而B16细胞用JQ1处理后，可显著减少细胞表面免疫抑制蛋白PD-L1的表达，提示JQ1可以通过降低PD-L1的表达解除免疫抑制，恢复机体抗肿瘤功能正常化，进而与紫杉醇联用，通过杀伤肿瘤细胞释放肿瘤抗原，激活机体免疫系统，共同发挥对肿瘤的治疗作用[13-14]。针对联合疗法治疗肿瘤的特点，今后尚需完成荷载PTX/JQ1的PLGA纳米粒动物体内抗肿瘤效果及作用机制的评价。