基于网络药理学和分子对接研究三七抗类风湿关节炎的分子机制

张潇文，应天昊，梁美辰，王艳芳，王信林，张雷明

(烟台大学 药学院 分子药理和药物评价教育部重点实验室，山东 烟台 264005)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种全身性自身免疫性疾病，属于中医学“痹症”的范畴，其主要临床表现为侵蚀性、对称性多关节炎。目前，类风湿关节炎的确切发病机制尚不明确，主要病理表现为关节滑膜的慢性炎症、血管翳形成，并逐渐出现关节软骨和骨破坏，后期发展为进行性关节损伤、功能丧失合并症[1]。类风湿关节炎可见于各个地区和种族，目前患病人数约占世界总人口的1.0%[2]。

中医药具有多靶点、多途径、多环节以及整体调节的特点，相比于传统化学药物的治疗，中药对RA的治疗具有一定的优势，临床实践证明，无论内服、外用、单方或联合等中医药治疗都取得了明显疗效。中医药治疗避免了化学药的毒副作用，适宜长期服用，具有明显优势[3]。三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)为五加科人参属植物三七的干燥根，具有抗血栓、抗炎、抗纤维化、调节免疫等作用，逐步被应用于临床，其在类风湿关节炎治疗方面也越来越受重视[4]。三七的药理作用主要体现在对血液系统、心脑血管系统、中枢神经系统、免疫系统等的影响[5]。三七的主要活性成分为三七总皂苷[6]，具有抗炎、改善细胞能量代谢、清除自由基及抗氧化应激、调控细胞凋亡信号通路、平衡离子代谢紊乱、改善组织血流供应等药理作用[7-12]，临床上常用于治疗心脑血管及神经系统疾病,亦可用于类风湿关节炎等自身免疫疾病[13]。

运用网络药理学的方法研究中药的结构、功效，弥补了以往中药研究中单靶点、单通路的思维缺陷。本研究拟采用网络药理学的方法揭示三七抗类风湿关节炎的分子机制，为新药研发及深入研究三七的作用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 三七活性成分及其作用靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索三七的主要成分，以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%及类药性(drug-likeness, DL)≥0.18为筛选条件，获得三七的主要活性成分。通过主要活性成分的编号(MOLID)，在TCMSP数据库的相关靶点检索功能(related targets)检索主要活性成分的潜在靶点，去除没有检索到靶点的活性成分，依次得到7种主要活性成分对应的潜在作用靶点。筛选结束后，统一应用Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org)将活性成分作用的蛋白质靶点进行规范，标准化蛋白质靶点信息，以便后续研究。

1.2 类风湿关节炎相关靶点的筛选

以“rheumatoid arthritis”为关键词，在GeneCards数据库(https://www.genecards.org)中检索类风湿关节炎的潜在靶点。在GeneCards数据库中，Score值越高则代表该靶点与疾病联系越密切。

1.3 三七活性成分-类风湿关节炎交集靶点筛选

利用R语言将三七活性成分作用靶点和类风湿关节炎作用靶点取交集并绘制维恩图，两者交集部分即为三七抗类风湿关节炎的潜在作用靶点。

1.4 三七活性成分-类风湿关节炎靶点PPI网络的构建

将交集靶点提交至STRING 11.0数据库(https://string-db.org)构建蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络模型，将生物种类设定为“Homo sapiens”，得到PPI网络。

1.5 三七活性成分-类风湿关节炎靶点生物功能与通路的富集分析

Metascape平台(http://metascape.org)可对靶点进行通路富集分析。将交集靶点导入Metascape平台进行GO(gene ontology)及KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析，设置P< 0.01，分析其主要的生物学过程与代谢通路并进行富集分析，保存其结果并通过R语言对结果进行可视化。

1.6 三七活性成分-类风湿关节炎靶点-通路网络图的构建

运用Cytoscape 3.7.2构建三七活性成分-类风湿关节炎靶点-通路网络图，利用Cytoscape 3.7.2内置工具分析有效成分及靶点的网络拓扑参数，包括连接度(degree)、介度(betweenness)及紧密度(closeness)等，并根据网络拓扑学参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

1.7 分子对接

从PPI及成分-靶点-通路网络图中选取关键靶点分别与关键成分进行分子对接，验证成分与靶点之间的可能性。从 Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb)数据库中检索获得受体蛋白(PDBID: 1UNQ)，利用AutoDock Vina 1.1.2对受体蛋白与配体小分子进行分子对接，对结合自由能进行打分。

2 结果

2.1 三七的活性成分及其作用靶点

在TCMSP数据库中根据OB和DL参数筛选初步获得8个成分，剔除1个未查询到靶点的成分，最终获得7个活性成分(表1)。对上述7个成分作用靶点加以预测，得到三七活性成分作用靶点202个，删除重复值后共得到靶点154个。利用Cytoscape 3.7.2对三七活性成分及其作用靶点的关系网络进行绘制和分析，共获得161个节点(包含154个靶点和7个活性成分)与202条边，图中节点的大小代表相应的连接度值，节点面积越大代表连接度值越大，表示涉及的生物功能越多，其生物学重要性越高(图1)。

表1 三七活性成分

注: 图中紫色代表活性成分作用的靶点；黄色代表7个活性成分。

2.2 类风湿关节炎相关靶点

从GeneCards数据库获得类风湿关节炎靶点4 465个。设定Score大于中位数的目标靶点为类风湿关节炎的潜在靶点，如通过GeneCards所得类风湿关节炎靶点Score最大值为110.06，最小值为0.15，中位数为1.44，故设定Score ≥1.44的靶点为类风湿关节炎的潜在靶点，最终得到2 237个类风湿关节炎相关靶点。

2.3 三七活性成分-类风湿关节炎靶点网络构建

应用R语言将三七活性成分和类风湿关节炎相关的作用靶点取交集，绘制维恩图(图2)，得到交集靶点100个，即三七活性成分抗类风湿关节炎作用的潜在靶点。

图2 三七活性成分-类风湿关节炎靶点维恩图

2.4 三七活性成分-类风湿关节炎靶点PPI网络的构建

将筛选得到的三七活性成分-类风湿关节炎100个交集靶点提交至 STRING 11.0平台，限定物种为“人”，选择交互作用大于0.4的靶点得到三七靶点PPI网络图数据。为了更加清楚地体现核心蛋白在PPI中的调控作用，通过Cytoscape 3.7.2进行可视化分析并通过内置的Network Analyzer分析得到最终PPI网络(图3)。共有98个节点，1 751条边。图中节点大小和颜色表示靶点的度值，节点越大，颜色由浅黄到橙色，表示靶点连接度值也就越大，反之表示越小。由图3可以看出，AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、JUN、CASP3、PTGS2等目标基因位于网络的核心位置，在PPI网络中发挥关键调控作用。

图3 三七-类风湿关节炎靶点PPI网络

2.5 三七抗类风湿关节炎潜在靶点生物功能与通路的富集分析

利用Metascape平台，将三七活性成分与类风湿关节炎交集靶点进行GO的生物过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和细胞组分(cell component, CC)富集分析，将P<0.01的项目进行筛选，总共富集到1 791条生物过程，131项分子功能相关，66项细胞组分相关。使用R语言按照富集的显著程度取排名前10的项目进行柱状图绘制(图4)。KEGG通路分析按P<0.01进行筛选，总共富集到304条信号通路，筛选排名前20的通路进行气泡图绘制(图5)。

图4 GO分析

图5 KEGG通路富集分析

2.6 三七活性成分-类风湿关节炎靶点-通路网络图的构建

运用Cytoscape 3.7.2构建三七成分-类风湿关节炎靶点-通路网络(图6)。通过 Cytoscape 3.7.2内置的Network Analyzer分析三七治疗类风湿关节炎网络拓扑学参数，得到核心成分及核心作用靶点。三七治疗类风湿关节炎的核心成分为槲皮素、人参皂苷rh2和β-谷甾醇等(表2)，最主要靶点为AKT1、RELA、MAPK1、CHUK、IL6、CASP3、JUN、NFKBIA、TNF、TP53等(表3)。

注:不同颜色的圆形节点为不同药物的活性成分，矩形为靶点，倒三角为通路；节点的面积及颜色透明度其代表其度数，面积越大、颜色越深说明该节点越重要。

表2 三七主要活性成分网络节点特征参数

表3 三七主要活性成分靶点网络节点特征参数

2.7 分子对接结果

使用AutoDock Vina软件对关键靶点和成分进行分子对接后，得到结合自由能打分，如表4所示，能值越低，表明二者的结合效果越好。表中AKT1与人参皂苷rh2和豆甾醇结合性最好，如图7所示，从图中可以看出AKT1与两种成分相互作用，结合后呈现稳定状态。

表4 与关键靶点AKT1的对接结果

图7 化学成分与AKT1的分子对接图

3 讨论

本研究筛选得到的活性成分主要有槲皮素、人参皂苷rh2、β-谷甾醇、豆甾醇、亚油酸乙酯、甘草素。槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物，广泛存在于植物的花、叶、果实中，具有抗炎、抗氧化、抗癌、抗纤维化等药理作用[14]，可以减轻大鼠急性痛风性关节炎的踝关节肿胀程度，并且能够降低炎症因子IL-1β、TNF-α、COX-2、NO的水平[15]，提示其具有抗类风湿性关节炎的潜力。人参皂苷Rh2具有抗氧化和抗炎的作用[16]，可以显著抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-α[17]，并且可以减少肺组织中LPS诱导的促炎性NO、肿瘤坏死因子-α的分泌，降低白介素IL-1β和IL-4、IL-6和IL-10水平[17]。β-谷甾醇是植物甾醇类成分之一，属于四环三帖类化合物，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、降血脂等药理作用[18]。豆甾醇是植物甾醇之一，常和油脂共存于许多植物种子和花粉中，能抑制多种炎症介质，从而减少骨关节炎引起的软骨退化，并可以通过阻断IL-1β诱导的NF-κB通路来发挥其抑制作用[19]。亚油酸乙酯是人体必需脂肪酸之一，有降低血清胆固醇和低密度脂蛋白、抗菌、抗炎等药理作用，可用于治疗动脉硬化、心绞痛等。亚油酸乙酯对钛颗粒和LPS诱导的细胞炎性因子的释放均有抑制作用，从而可以减轻炎症反应[20-21]。甘草素是从中药甘草中提取的一种黄酮类化合物单体，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用[22]，对LPS诱导的骨关节炎软骨细胞损伤具有保护作用[23]。

本研究筛选得到三七-类风湿关节炎共同作用靶点100个，其中核心靶点包括AKT1、IL6、VEGFA、TNF、TP53、JUN、CASP3、PTGS2。为了进一步研究共同作用靶标在基因功能和信号通路方面的作用，进行了GO分析和KEGG分析。GO分析共获得1064条信号通路，KEGG分析获得102条信号通路，其中与类风湿关节炎相关的信号通路包括AGE-RAGE、MAPK、TNF、IL-17以及HIF-1等。AGE(糖基化终产物)-RAGE(糖基化终产物受体)信号通路在糖尿病及其并发症的形成与发展中发挥重要作用，AGEs可以激活RAGE，会引起轻度全身性炎症反应和氧化作用[24]，三七皂苷等复方制剂可以降低AGE和RAGE的表达[25]。MAPK信号通路被激活后会产生大量促炎性细胞因子和MMP(基质金属蛋白酶)，促进成纤维样细胞的迁移和侵袭，导致滑膜炎症、关节破坏[26-27]。TNF信号通路中，TNF-α能促进软骨破坏，加重炎性反应，促进类风湿关节炎的发生。在类风湿关节炎活动期及进展期，TNF-α表达明显增加[28]。IL-17信号通路是Th17细胞活化和维持的关键通路，在类风湿性关节炎等多种炎症性疾病中，尤其是在类风湿关节炎关节症状的形成中发挥重要作用[29-30]。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β组成，HIF-1α在小鼠膝关节炎中表达明显升高[31]。

综上所述，本研究应用网络药理学和分子对接阐释了三七的活性成分、靶点及通路之间相互作用的关系，三七的活性成分可通过多靶点、多通路发挥抗类风湿关节炎效应，为三七治疗类风湿关节炎的开发及应用提供了理论依据。