基于网络药理学的盐酸小檗碱治疗抑郁症作用机制研究▲

吴 进 王振辉 李 慧 肖 凯 王 芳 吴 佳

(湖南省妇幼保健院药学研究部，长沙市 410008，电子邮箱：wuon4616@163.com)

抑郁症是一种较为常见的精神障碍疾病，主要表现为情绪低落、焦虑、精力不集中、失眠等。中国现有抑郁症患者超过9 500万[1-2]，据世界卫生组织报告,抑郁已成为中国疾病负担第二顺位，预计2030年将上升至世界疾病负担首位[3]，这将给社会带来巨大的经济压力。但抑郁症存在致病因素复杂、发病机制尚不清楚、临床治愈率低等问题。有研究表明，盐酸小檗碱单独使用或者联合抗抑郁药物使用能够改善患者的抑郁情况[4-5]；在临床工作中笔者也发现，服用盐酸小檗碱的患者，其抑郁症状得到相应的改善。但盐酸小檗碱干预抑郁的作用机制还不甚明确。

网络药理学是一种基于系统生物学、多向药理学、计算机虚拟运算及网络数据库检索为一体的新型学科，其可以将某些药物和相关疾病紧密联系起来，建立“药物-靶点-疾病”多层次的网络结构，可帮助学者从系统和整体的角度预测和阐明药物作用靶点及其潜在的作用机制，为药物研究者提供新的思路和技术手段。故本研究从现代医学的角度，运用网络药理学探讨盐酸小檗碱治疗抑郁症的作用机制，为进一步推广盐酸小檗碱的临床应用提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 盐酸小檗碱靶点的筛选及蛋白质相互作用网络构建 利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP；http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)检索盐酸小檗碱的作用靶点[6]；同时获得盐酸小檗碱化学结构的mol2格式文件，将mol2格式文件上传至PharmMapper数据库(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/submitjob.html)进行靶点预测[7]并获取前300个靶点(根据Maximum Generated Conformations排序筛选)的名称等信息。通过Excel软件对TCMSP数据库和PharmMapper数据库获得的靶点进行合并、去重后，将靶点信息输入UniProt数据库(http://www.uniprot.org/)中进行检索、校正，删除不规范及重复靶点，得到小檗碱的作用靶点[8]。将小檗碱的作用靶点导入STRING数据库(https://cn.string-db.org/)，选定物种为人，构建与靶点有相互作用的蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络，以获得更多盐酸小檗碱的潜在作用靶点；导出小檗碱潜在作用靶点的PPI网络文件，使用Cytoscape 3.5.1(http://www.cytoscape.org/)进行可视化分析[9]；然后对网络的拓扑结构进行分析，以中介中心度(betweenness centrality,BC)、邻近中心度(closeness centrality,CC)和度值(Degree)大于平均数为标准筛选盐酸小檗碱的核心潜在作用靶点。

1.2 抑郁症相关靶点的筛选 在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中，以“depression”“depressive” “antidepressant”为关键词进行检索[10]，获得抑郁症的相关靶点。

1.3 盐酸小檗碱治疗抑郁症潜在靶点的确认及PPI网络构建 利用Excel软件对1.1获得的小檗碱相关PPI网络中的靶点与1.2获得的疾病相关靶点，得到盐酸小檗碱治疗抑郁症的潜在作用靶点，按照1.1的方法构建小檗碱治疗抑郁症的潜在作用靶点的PPI网络，并对网络的拓扑结构进行分析，以BC、CC、度值均大于平均值获得小檗碱治疗抑郁症的核心潜在作用靶点。

1.4 盐酸小檗碱治疗抑郁症潜在作用靶点的富集分析 利用生物信息学注释数据库DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)[11]对获得的盐酸小檗碱治疗抑郁症的潜在作用靶点进行基因本体论(Gene Ontology，GO)功能富集分析、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析，采用Bonferroni法校正后，以P<0.01的项目为显著富集[12-13]。

2 结 果

2.1 盐酸小檗碱的作用靶点 TCMSP共检索到盐酸小檗碱靶点29个，将其与PharmMapper预测的300个盐酸小檗碱靶点进行合并、去重，选定物种为人，共得到盐酸小檗碱的潜在作用靶点218个。将这218个靶点导入STRING数据库构建与其有相互作用的PPI网络，从网络中共获得267个盐酸小檗碱的潜在作用靶点，见图1；运用Cytoscape软件将PPI网络进行可视化，对网络的拓扑结构进行分析，结果显示BC、CC和度值的平均值分别为0.010 5、0.334 8和8.29，且BC、 CC和度值均大于平均数的靶点共有42个(见表1)，即为盐酸小檗碱的核心潜在作用靶点。

图1 盐酸小檗碱潜在作用靶点的PPI网络

表1 盐酸小檗碱的核心潜在作用靶点

2.2 盐酸小檗碱治疗抑郁症的作用靶点 在GeneCards网站中共检索到抑郁症相关靶点14 271个，将其与267个盐酸小檗碱的潜在作用靶点取交集后，得到184个盐酸小檗碱治疗抑郁症的潜在作用靶点，见图2。将这184个盐酸小檗碱治疗抑郁症的潜在作用靶点导入STRING数据库后，运用Cytoscape软件构建可视化PPI网络(见图3)，对网络的拓扑结构进行分析，结果显示BC、 CC和度值的平均值分别为0.010 1、0.382 4和11.73；BC、 CC和度值均大于平均数的靶点共有35个，即为盐酸小檗碱治疗抑郁的核心潜在作用靶点(见表2)。根据网络拓扑结构分析结果，在表1和表2中，BC、 CC和度值排名均位于前10的靶点共有7个，分别是白蛋白(albumin，ALB)、热激蛋白90αA1(heat shock protein 90 alpha family class A member 1，HSP90αA1)、细胞色素C(cytochrome C,somatic，CYCS)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、雌激素受体1(estrogen receptor 1，ESR1)、周期蛋白依赖性激酶2(cyclin-dependent kinase 2，CDK2)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)。

图2 盐酸小檗碱治疗抑郁症潜在作用靶点的韦恩图

图3 盐酸小檗碱治疗抑郁症潜在作用靶点的PPI网络

表2 盐酸小檗碱治疗抑郁症的核心潜在作用靶点

2.3 盐酸小檗碱治疗抑郁症潜在作用靶点的富集分析 将得到的184个盐酸小檗碱治疗抑郁症的潜在作用靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。最终共得到184个GO生物学过程，其中G1/S有丝分裂细胞周期、对药物的反应、对缺氧的反应、DNA复制、对雌二醇的反应、对雌激素的反应、凋亡过程的负调控、积极调控成纤维细胞增殖、积极调控细胞增殖、肽丝氨酸磷酸化、有丝分裂细胞周期检查点、细胞分裂、氧气运输等24个生物学过程具有统计学意义(P<0.01)，见表3。盐酸小檗碱治疗抑郁症的潜在作用靶点涉及的KEGG富集通路共45个，其中细胞周期、p53信号通路、叉头框蛋白O(forkhead box O,FoxO)信号通路、催乳素信号通路、抗生素的生物合成、精氨酸生物合成、氨基酸的生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢等18个KEGG信号通路具有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表3 盐酸小檗碱治疗抑郁症潜在作用靶点的GO功能富集分析结果

表4 盐酸小檗碱治疗抑郁症潜在作用靶点的KEGG富集分析结果

3 讨 论

已有学者报告，盐酸小檗碱能够改善肠易激综合征患者的焦虑症状[3]；对于既往经三环类抗抑郁药及5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂系统治疗但症状改善不理想的重度抑郁障碍患者，联合小檗碱治疗后，抑郁症状和躯体疼痛相关症状可获得显著改善[14]；盐酸小檗碱联合艾司西酞普兰能够改善老年抑郁症患者的睡眠障碍，并显著降低汉密尔顿抑郁量表评分[4]。在动物实验中，不同学者均发现盐酸小檗碱能够改善小鼠的抑郁样行为[15-17]，说明小檗碱有一定的抗抑郁作用[18]。

我们将盐酸小檗碱的潜在作用靶点与抑郁症相关靶点进行对比并取交集，得到盐酸小檗碱治疗抑郁症的潜在作用靶点共184个。利用STRING数据库构建PPI网络，通过Cytoscape软件进行分析后发现，ALB、HSP90αA1、CYCS、ESR1、CDK2等靶点较为重要。徐静等[19]研究发现，抑郁症患者体内血清ALB水平与汉密尔顿抑郁量表评分呈负相关，其机制可能与抑郁症患者体内普遍存在炎症相关因子，并伴有炎症反应激活，而炎症相关因子可促使胰岛素样生长因子1大量分解，进而抑制肝脏蛋白合成有关[20]。韦珏伶等[21]发现中重度抑郁组肝癌患者HSP90αA1/HSPA8的表达显著高于无抑郁组和轻度抑郁组，提示HSP90αA1与抑郁存在密切联系。孔令韬等[22]的动物实验结果表明，慢性应激抑郁模型大鼠海马组织中CYCS的表达水平降低，抗抑郁药物氟西汀和噻奈普汀可能通过抑制神经元内线粒体释放CYCS，达到减少应激导致的神经元凋亡，从而起到治疗抑郁的作用。CDK2的作用不仅局限于调控细胞周期，而且能够参与对神经细胞凋亡的调控，从而影响抑郁症状[23]。有学者发现ESR1基因多态性与女性围绝经期抑郁症状存在关联，而其与5-羟色胺基因多态交互作用可能增加女性围绝经期抑郁的风险[24-25]。

我们将184个盐酸小檗碱治疗抑郁的潜在作用靶点导入DAVID数据库，进行GO生物学功能分析，结果显示，这些靶点参与细胞增殖分化、细胞凋亡、对细胞周期的调节，以及多种蛋白、氨基酸、脂质代谢和缺氧的调控。对184个靶点进行KEGG通路富集分析，结果显示，这些靶点能够对细胞周期、p53信号通路、FoxO信号通路、多种营养物质的合成等进行调节。以上结果提示盐酸小檗碱可通过多层次、多途径发挥治疗抑郁症的作用。

有研究结果表明，抑郁症的病因与应激引起的神经元细胞的萎缩和死亡有关[26-27]。 p53是细胞应激反应的关键调节因子， p53信号通路的激活可诱导神经元凋亡，这可能是导致抑郁症发生和发展的原因之一[28]。也有研究显示，DNA的表观遗传学修饰在抑郁症的发生和发展中发挥重要作用[29-30]。以上均表明，抑郁症的发生与细胞增殖、凋亡、细胞周期有着密切联系。并且多种抗抑郁药物能够通过调控细胞周期、抑制细胞凋亡、促进神经细胞增殖，从而发挥神经保护作用，起到治疗抑郁的效果[26，31-32]。而我们通过网络药理学的研究发现，盐酸小檗碱也能影响细胞周期、凋亡、增殖等多个过程，并可参与p53信号通路的调控。

近年有研究表明，大脑中氧化应激水平的升高和能量代谢的异常在抑郁症的发病机制中起着重要作用[33-36]。缺氧诱导因子1可调节糖代谢、能量代谢、血管新生、炎症因子等相关基因的表达，以应对组织中氧含量的降低或缺氧[37]。缺氧诱导因子1还可通过介导线粒体代谢来减轻氧化应激，从而发挥抗缺氧作用[38]。因此，间歇性低氧适应和高压氧治疗被认为是治疗抑郁症的新的补充疗法[39]。而在本研究中，我们也发现，盐酸小檗碱能够调节对缺氧的反应，说明其可能会通过对缺氧的调节，发挥治疗抑郁症的作用。

FoxO在细胞生理和生物学中发挥着重要作用。有研究结果表明，FoxO参与了严重抑郁障碍的发生：FoxO上游分子的改变，如脑源性神经营养因子或蛋白激酶B被认为与抑郁症有关[40]；此外，FoxO可能受5-羟色胺和去甲肾上腺素受体信号及下丘脑-垂体-肾上腺轴的调节，而FoxO可调节神经元形态、突触发生和成年海马神经发生[41]；黄英杰等[42]已经证实FoxO 1抑制剂AS1842856能够逆转高脂饮食引起的小鼠抑郁样行为。而本研究中，我们发现盐酸小檗碱可能通过调节FoxO信号通路，发挥治疗抑郁症的作用。

综上所述，盐酸小檗碱可能通过p53信号通路、FoxO信号通路、调控缺氧等多种途径发挥治疗抑郁症的作用，其中有部分靶点和作用机制已有文献证实，在一定程度上证明了本研究的可靠性，其余作用靶点和作用机制尚需进一步探索和证实。