检测IgH基因重排残留量在多发性骨髓瘤治疗中的应用价值

陈炎添，张雅西，郭翼华，苏雪棠

（江门市人民医院1. 检验科 2. 血液科，广东 江门 529020）

多发性骨髓瘤（MM）是一种以产生单克隆免疫球蛋白的异常浆细胞在骨髓内恶性增殖为主要特征的B 细胞系恶性肿瘤。近年来，以沙利度胺、硼替佐米等为代表的新药不断出现，使得MM 患者的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）得到延长。此病患者经诱导治疗其病情可达到完全缓解（CR），但一些患者会出现微小残留病变（MRD）。目前临床上主要是依靠骨髓细胞形态分析来判断MM 患者的治疗效果[1]。但当此病患者骨髓瘤细胞的数量处于微小残留量时，对其进行骨髓细胞形态分析就会出现一定的局限性，很难通过骨髓细胞形态分析来判断其是否需要继续接受治疗，从而易导致其病情复发。临床研究发现，在MM 发生发展的过程中伴随着多种特异的细胞遗传学层次上的相关基因数目或结构的改变，主要以免疫球蛋白重链（IgH）基因重排为主[2]。本研究通过采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测MM 患者的IgH 基因重排残留量，探讨MM患者经治疗后病情复发的可能性及IgH 基因重排残留量与MRD 的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018 年1 月至2021 年5 月期间我院收治的65 例MM 患者作为研究对象。其病情均符合MM 的诊断标准[3]，且均自愿参与本研究。在这些患者中，有男38 例，女27 例；其年龄为41 ～78 岁，平均年龄为（61.56±8.21）岁；其中，初诊患者有18 例，定期入院接受化疗的患者有47 例；免疫球蛋白分型为IgG 型的患者有52 例，为IgA 型的患者有6 例，为IgM 型的患者有5 例，为IgE型的患者有2 例。

1.2 材料

7500 Real Time PCR System 基 因 扩 增仪（ 美 国ABI 公 司 生 产 ），Genomic DNA Purification Kit 试剂盒。IgH 通用PCR 引物：VH 5’-ACACGGCCGTGTATTACTGT-3’，JH 5’-ACCTGAGGAGACGGTGACC-3’[4]。每次试验均设一阴性对照品和阳性对照品，阴性对照品为K562 细胞株（慢性粒细胞白血病急性变细胞系），阳性对照品为U266 细胞株（MM 细胞系）。K562 细胞株和U266 细胞株经PBS 缓冲液洗涤后可直接提取DNA。

1.3 治疗方法

采用VMP 方案（硼替佐米+ 马法仑+ 泼尼松）对本研究中65 例患者进行化疗，共进行6 个周期的化疗。

1.4 IgH 基因PCR 扩增的步骤

溶解所需试剂，振荡混匀后进行1 min 的离心处理。配置反应体系，包括上游引物：0.3 μL，下游引物：0.3 μL，模板DNA ：2 μL，SYBR Green I Real time PCR Master Mix ：6.75 μL，双蒸水：5.65 μL，总体积为15 μL。将上述反应体系在RT-PCR 仪中进行PCR 反应，按反应条件在95℃下预变性10 min，在95℃下变性15 s，在57 ℃下退火20 s，在68 ℃下延伸1 min，共40 个循环。完成PCR 循环后作融解曲线分析，95℃15 s，55℃15 s，95℃15 s，融解曲线的峰值为86.4℃，利用融解曲线可将特异产物和非特异产物分开。

1.5 骨髓细胞形态涂片检查

染液选用瑞氏- 姬姆萨染液（由珠海贝索生物技术有限公司生产），所有患者均于髂前上棘部位采集骨髓，抽取骨髓0.2 ～0.5 mL，并迅速进行涂片。选取厚薄适中且有骨髓小粒的骨髓涂片进行染色，在低倍镜及油镜下分类计数200 个有核细胞，观察其中是否有骨髓瘤细胞并计数。患者经治疗达到临床完全缓解（CCR）后病情复发的诊断依据是其骨髓涂片中骨髓瘤细胞的比例超过5%。

1.6 观察指标

观察65 例患者经6 个周期的化疗后其病情的缓解情况。将其病情的缓解情况分为CCR、部分缓解（PR）和未缓解（NR）。观察经治疗达到CCR 的患者IgH 基因重排呈阳性的情况。观察65例MM 患者中不同免疫球蛋白分型患者的IgH 基因重排拷贝数与骨髓瘤细胞比例。

1.7 统计学方法

用SPSS 20.0 软件处理本研究中的数据，计量资料用±s表示，用t检验，计数资料用% 表示，用χ² 检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 65 例患者治疗后病情的缓解情况

本研究中65 例患者经6 个周期的化疗后，其中病情达到CCR 的患者有54 例，达到PR 的患者有9 例，NR 的患者有2 例。

2.2 经治疗达到CCR 的54 例患者IgH 基因重排呈阳性的情况

在经治疗达到CCR 的54 例患者中，有31 例患者的IgH 基因重排呈阳性。这31 例患者在治疗前及经治疗达到CCR 后，其IgH 基因重排拷贝数无显著变化（P＞0.05），其骨髓瘤细胞的比例有显著变化（P＜0.01）。详见表1。将这31 例IgH基因重排呈阳性的患者重新分为两组，一组为继续治疗组（n=16），一组为停止治疗组（n=15）。继续治疗组患者一直治疗到IgH 基因重排转阴为止，其中部分患者最长延长了5 个治疗周期，治疗后继续治疗组患者的病情均未复发。停止治疗组患者在停止治疗后，其病情均复发。这说明，经治疗达到CCR 的MM 患者，若其IgH 基因重排呈阳性，则其病情复发的可能性会大大增加。

表1 经治疗达到CCR 的54 例患者中31 例IgH 基因呈阳性患者的情况

2.3 65 例MM 患者中不同免疫球蛋白分型患者的IgH 基因重排拷贝数与骨髓瘤细胞的比例

在65 例不同免疫球蛋白分型的MM 患者中，免疫球蛋白分型为IgG 型和IgA 型的患者经治疗达到CCR 后，其IgH 基因重排拷贝数偏高；免疫球蛋白分型为IgG 型、IgA 型、IgM 型、IgE 型的患者经治疗达到CCR 后，其骨髓瘤细胞的比例均偏低。详见表2。结合表2 和表3 不难发现，免疫球蛋白分型为IgG 型和IgA 型的MM 患者经治疗达到CCR 后，其病情更易复发。

表2 65 例MM 患者中不同免疫球蛋白分型患者的IgH 基因重排拷贝数与骨髓瘤细胞的比例

3 讨论

本研究中65 例MM 患者采用VMP 方案进行治疗后，取得了很好的疗效。此病患者经治疗病情可达到CR，但由于MRD 的存在，可导致其体内的IgH 基因出现微小残留，IgH 基因会不断复制，当复制到一定数量时，就会导致患者的病情复发。目前临床上主要是依靠骨髓细胞形态分析来评估MM 患者的临床疗效。但对此病患者进行骨髓细胞形态分析具有一定的局限性，无法准确地评估其是否应继续接受治疗，易导致其病情复发。在MM 的发病机制中，IgH 基因重排作为新的研究方向，在国内外已有相关报道[5]。本研究发现，治疗后MM 患者的IgH 基因重排拷贝数若降到50 以下，其病情可达到CR。对于治疗后IgH 基因重排拷贝数小于50 的患者，每隔一段时间检测其IgH基因重排拷贝数可作为监测其病情复发及进展的手段之一。对于病情达到CR 的患者，若其IgH基因重排拷贝数未转为阴性，仍需继续接受治疗。在治疗期间利用RT-PCR 技术检测患者的IgH 基因重排残留量可作为评估其疗效和预后及监测MRD 的参考指标之一[6]。本研究的结果表明，IgH基因重排拷贝数与MM 的免疫球蛋白分型有关，IgG 型MM 患者的IgH 基因重排拷贝数高于其他免疫球蛋白分型患者。从本研究中的表1 可以看出，骨髓内骨髓瘤细胞的比例与IgH 基因重排拷贝数有相关性，IgH 基因重排拷贝数越高，骨髓内骨髓瘤细胞的比例就越高。经治疗病情达到CR的MM 患者，若其骨髓瘤细胞的比例达到CR 的诊断标准，而IgH 基因重排拷贝数呈阳性，说明对其进行骨髓细胞形态分析难以检测出MRD，应通过检测IgH 基因重排残留量评估其疗效[7]。

综上所述，采用RT-PCR 法检测MM 患者治疗后的IgH 基因重排残留量能指导临床治疗，有助于预防其病情复发，提高其临床疗效。