苹果酸—乳酸发酵对刺梨酒香气的影响

郭志君 杨 磊 骆红霞 周模美 房玉林

(1. 茅台学院，贵州 仁怀 564500；2. 西北农林科技大学，陕西 咸阳 712100)

刺梨(RosaroxburghiiTratt)为蔷薇科多年生落叶灌木植物，具有防风固沙生态保护作用，同时含有较高的抗坏血酸、酚类等生物活性成分[1]，已成为贵州省乡村振兴特色产业之一，截至2020年，贵州省刺梨鲜果产量超10万t[2]。刺梨加工产品种类丰富，尤其刺梨酒一直是研发热点[3]，但由于刺梨果实含酸量高，发酵酒口感酸涩粗糙、风味欠佳。国内外学者在改善刺梨发酵酒风味方面进行了相关研究[4-6]，主要基于不同澄清材料选择、酵母菌种筛选、发酵工艺参数优化、水果复配等方法平衡口感。

苹果酸—乳酸发酵(malolactic fermentation，MLF)是一种有效的生物降酸方法，在乳酸菌的作用下将高酸感的苹果酸转化为低酸感的乳酸，增加酒体的圆润度，同时产生其他香气风味物质[7]，被广泛用于葡萄酒发酵过程以及酸度较高果汁的降酸处理[8]，MLF对野生猕猴桃[9]、蓝莓[10]、樱桃[11]、桑葚[12]等果酒品质的影响已有报道，目前尚未有对刺梨酒进行MLF的相关报道。

有机酸种类含量、挥发性成分共同影响刺梨酒的口感风格和典型性，研究拟选用贵州省毕节刺梨顺序进行酒精发酵(AF)和MLF，以单一酒精发酵为对照，采用离子色谱法和顶空固相微萃取—气相色谱质谱法(HS-SPME/GC-MS)对刺梨酒中的有机酸和挥发性成分进行定性定量分析，结合香气活度值(OAV)和感官分析，探究MLF对刺梨酒的降酸效果、挥发性成分和口感的影响，以期达到降酸和改善刺梨酒风味的目的，为刺梨酒开发应用提供一定理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜贵州省毕节刺梨、蔗糖：市售；

偏重亚硫酸钾：意大利DAL CIN公司；

澄清果胶酶RCL：德国AB Enzymes公司；

酿酒酵母ST：法国Laffort公司；

酒类酒球菌(Oenococcus oeni)Viniflora CH35：丹麦Chr.hansen公司；

有机酸标准品(纯度>99%)、4-辛醇：北京索莱宝科技有限公司；

乙醇、碳酸氢钠、2,6-二氯靛酚、偏磷酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

50/30 μm CAR/PDMS/DVB萃取纤维头：西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

离子色谱仪：Dionex ICS-1500型，美国Thermo Scientific公司；

阴离子分离柱(4 mm×250 mm)：IonPACAS11-HC型，美国Thermo Scientific公司；

保护柱(4 mm×50 mm)：IonPAC®AG11-HC型，美国Thermo Scientific公司；

气相色谱—质谱联用仪：7980A-5977B型，美国Agilent公司；

多功能样品前处理平台：MPS XT型，德国Gerstel公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨酒发酵工艺

原料挑选→破碎压榨→刺梨汁澄清→成分调整→酒精发酵→MLF→终止发酵→酒样

操作要点：挑选成熟的无霉变鲜刺梨果进行清洗、压榨取汁，过程中分次加入100 mg/L偏重亚硫酸钾，30 min后加入果胶酶室温放置3 h，6 ℃低温澄清24 h取清汁并用蔗糖调整其总糖度为150 g/L，回温后接种已活化的酵母200 mg/L进行酒精发酵，控温18～20 ℃，总糖小于4 g/L时发酵结束，1/2酒样添加偏重亚硫酸钾120 mg/L，4 ℃保存(对照酒样)；其余酒样添加酒类酒球菌1 g/L继续进行MLF，控温18～20 ℃，发酵结束时添加偏重亚硫酸钾120 mg/L，4 ℃保存待测。

1.3.2 刺梨酒有机酸含量测定 草酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸采用离子色谱法，参考SN/T 4675.5—2016《出口葡萄酒中有机酸的测定 离子色谱法》稍做修改，配制7种有机酸混合标准溶液，混合标准溶液中乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸的质量浓度分别为1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L，苹果酸、酒石酸、草酸的质量浓度分别为2.0，5.0，10.0，20.0，40.0 mg/L，酒样稀释后经0.45 μm水系滤膜过滤待测。柱温箱温度35 ℃，柱温30 ℃，KOH淋洗液，多级梯度淋洗，淋洗液流速0.8 mL/min，抑制电流150 mA，进样量25 μL。保留时间定性，外标法定量。

抗坏血酸采用2,6-二氯靛酚滴定法，按GB 5009.86—2016《食品安全国家标准 食品中抗坏血酸的测定》执行。

1.3.3 刺梨酒中挥发性成分测定 参考郭志君等[13]的方法。

1.3.4 香气活度值(OAV)计算 采用挥发性物质的含量与其阈值之比。阈值受溶剂及分析方法影响较大，目前并没有刺梨酒中香气阈值的文献报道，参考与刺梨酒酒精度相近溶液中的阈值[14]，首选低醇(9%～14%)酸性水溶液、其次为葡萄酒和水。一般认为，OAV≥1.0的化合物单独对酒的香气有贡献，0.1≤OAV<1.0对香气有重要修饰作用[15]。

1.3.5 感官评价 采用QDA法[16]，由10位专业感官品评员(5名男性和5名女性)对刺梨酒MLF前后的样品进行感官评价，获得评价的主要感官描述词，并对样本进行5点标度法打分，取平均分值作感官评定雷达图。

1.4 数据分析

采用Excel和SPSS 21.0对试验数据进行处理，并进行差异显著性分析，以P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 MLF对刺梨酒有机酸含量的影响

采用离子色谱法对刺梨酒中有机酸进行定性定量分析，测得刺梨酒中主要8种有机酸，分别为草酸、酒石酸、抗坏血酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸，虽然抗坏血酸不含自由羟基属于己糖内酯化合物，但因其分子可游离出H+具有有机酸的性质，因此归为一类分析。由表1可知，经MLF刺梨酒总有机酸含量降低了1.40 g/L；苹果酸含量由6.21 g/L降至0.88 g/L，显著降低85.83%；而乳酸含量由0.55 g/L增至4.49 g/L，显著升高87.75%，变化趋势与葡萄酒中的研究结果近似[17]。具有生青味、酸涩的苹果酸经MLF脱缩转化为柔和、有乳香味的乳酸，有利于改善刺梨酒酸涩生青的口感。刺梨酒经过MLF乙酸含量升高0.11 g/L，部分乙酸为乳酸菌代谢柠檬酸等物质产生，一定程度上有利于形成更多的酯类香气物质，丰富刺梨酒的果香，但含量过高则产生酸败风味。MLF对其他有机酸含量无显著影响，检测到刺梨酒中的抗坏血酸含量仅为0.34 g/L，远低于果实中的含量[18]，但高于彭小东等[19]采用HPLC法测定的刺梨酒中0.077 g/L的抗坏血酸含量，主要因为抗坏血酸化学性质不稳定、易被氧化，在果酒酿造过程中极易损失，贮藏条件和检测方法对刺梨酒中抗坏血酸的含量有影响。

表1 MLF对刺梨酒有机酸含量的影响†Table 1 Effect of MLF on organic acid of Rosa roxburghii Tratt wine g/L

2.2 MLF对刺梨酒挥发性成分的影响

2.2.1 MLF对挥发性成分种类和含量的影响 采用HS-SPME/GC-MS技术检测MLF后的刺梨酒(AF-MLF)的挥发性成分种类和含量，共鉴定出114种挥发性成分，其中包括酯类48种、醇类26种、酸类13种、醛酮类10种、烷烃类10种、其他化合物7种，结果见表2。

表2 MLF对刺梨酒挥发性成分及香气活度值的影响†Table 2 Effect of MLF on volatile components and odor activity value of Rosa roxburghii Tratt wine

续表2

续表2

续表2

酯类物质是刺梨酒中种类最多、含量最高的挥发性成分，占总挥发性物质含量的70%以上。酯类多数具有水果香和花香[24]，并且阈值较低，是刺梨酒整体香气的重要组成部分。MLF后共检出48种酯类，总含量为12 011.60 μg/L，比对照提高10.81%，主要包括辛酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸异戊酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、(E)-3-己烯-1-醇乙酸酯、乙酸叶醇酯、乙酸苯乙酯、乙酸己酯、反式-肉桂酸乙酯等。与对照相比，仅在MLF后的酒样中检测到的酯类有11种，包括乙酸叶醇酯、DL-3-乙酰氧基丁酸乙酯、3-己烯酸乙酯、辛酸辛酯、肉桂酸异戊酯、乳酸异戊酯等，主要表现出甜香、奶油香、椰子香等；经过MLF刺梨酒中的(E)-3-己烯-1-醇乙酸酯、乙酸己酯含量明显降低，这些物质具有植物、青果味，而具有香蕉、菠萝成熟果香的辛酸乙醇含量则升高14.00%。说明MLF可提高刺梨酒中酯类物质的种类和含量，总体向果香和奶油香发展，与葡萄酒中的研究结果[25]相似。

醇类物质占刺梨酒总挥发性化合物含量的8%左右，多数醇类由酵母代谢氨基酸产生，香气类型较为丰富，低浓度常具有清香、较高浓度易产生刺激性气味。在MLF后的酒样中检测到26种醇类，总含量为1 409.50 μg/L，比对照增加218.30 μg/L，但总体占比降低0.29%。具有香料紫罗兰气味的紫苏醇、正辛醇等仅在MLF后的酒样中检测到，而具有植物、青草气味的反式-3-己烯-1-醇仅在对照酒样中检测到，但MLF的酒样中也检测到375.60 μg/L具有青草味的叶醇，具有玫瑰花香气的苯乙醇由440.40 μg/L降至13.70 μg/L，说明MLF改变了刺梨酒中挥发性醇类物质的种类，但整体香气类型变化不明显，而总体高级醇占比下降对提高刺梨酒安全性有一定益处[26]。

刺梨酒中酸类物质含量经MLF后由1 040.40 μg/L增至2 490.60 μg/L，13种酸类化合物中十一烷酸、亚油酸、油酸和壬酸仅在MLF后的酒样中检测到，虽然这些高级饱和脂肪酸多数具有油脂、酸败气味，但因阈值较高，对刺梨酒影响有限。具有奶酪味的辛酸在MLF后由431.20 μg/L增加至1 658.60 μg/L，丰富了刺梨酒的奶酪气息。

刺梨酒MLF后烷烃类化合物种类由13种减少到10种，但含量提高了171.70 μg/L，特别是具有花香、甜香的苯乙烯和4-甲氧基苯乙烯增加了198.70 μg/L；醛酮类和其他物质含量占挥发性成分的2%左右，刺梨酒MLF前后总含量变化不大，但具有清新植物气味的庚醛在MLF后未检测到，出现具有香料气味的4-烯丙基苯甲醚、二氢沉香呋喃和2-甲氧基-5-丙-2-烯基苯酚。

2.2.2 MLF对OAV的影响 一般认为挥发性化合物含量大于其气味阈值，即OAV≥1，化合物产生的香气才可在气味中独立识别。由表2可知，MLF后刺梨酒的主要呈香物质(OAV≥1)共有13种，其中辛酸乙酯(OAV=928.18)是刺梨酒最主要的香气物质，其他贡献度大小依次为己酸乙酯(65.20)>乙酸异戊酯(34.48)>9-癸烯酸乙酯(23.25)>乙酸叶醇酯(13.68)>癸醛(7.88)>癸酸乙酯(4.50)>苯乙烯(2.41)>十一烷酸(2.35)>反式-肉桂酸乙酯(2.09)>乙酸苯乙酯(1.67)>癸酸甲酯(1.58)>4-辛酮(1.40)，其中具有青苹果、黄瓜香气的乙酸叶醇酯和奶酪香气的十一烷酸仅在MLF后的酒样中检测到，具有植物、泥土气味的庚醛(4.14)和反式-3-己烯-1-醇(2.28)则只在对照酒样中检测到，说明MLF提高了刺梨酒果香花香，特别是奶油乳酪香气，同时减少了生青气息，但依然保留了刺梨酒独特的清新果味。对刺梨酒香气具有重要修饰作用(0.1≤OAV<1.0)的物质检测到10种，其中辛酸和叶醇仅在MLF的酒样中检测到，对刺梨酒香气的影响与主要呈香物质基本一致。

2.3 MLF对刺梨酒感官评价的影响

采用QDA法对MLF前后的刺梨酒进行感官评定，结果见图1。由图1可知，刺梨酒MLF前后的共同主要味感描述为果香、花香、植物香、乳香、酸味、苦涩味。对照酒样以果香、花香、植物香、酸味、苦涩味为主；MLF后的刺梨酒以果香、花香、乳香、酸味为主。相较于仅进行酒精发酵的刺梨酒，MLF后刺梨酒花香、植物香减弱、果香乳香增加、酸味减弱、苦涩味稍减弱，口感平衡度提升，风味轮廓发生变化，经过MLF的酒样的整体评分高于对照组。

图1 MLF对刺梨酒感官评定雷达图Figure 1 Radar chart of sensory evaluation of Rosa roxburghii Tratt wine by malolactic fermentation

3 结论

研究采用离子色谱法测定出刺梨酒中有8种有机酸，苹果酸—乳酸发酵使刺梨酒中苹果酸含量显著降低85.83%、乳酸含量显著升高87.75%、乙酸含量增加0.11 g/L，对草酸、酒石酸、柠檬酸和琥珀酸含量无显著影响；采用HS-SPME/GC-MS鉴定出苹果酸—乳酸发酵后的刺梨酒中有114种、16 903.10 μg/L挥发性成分，其中酯类、醇类和酸类共占94.13%，为主要挥发性成分，苹果酸—乳酸发酵后挥发性物质的种类和总含量均高于对照酒样，仅在苹果酸—乳酸发酵的酒样中检测到的成分主要有乙酸叶醇酯、DL-3-乙酰氧基丁酸乙酯、3-己烯酸乙酯、辛酸辛酯、肉桂酸异戊酯、乳酸异戊酯、紫苏醇、正辛醇、十一烷酸、亚油酸、油酸、壬酸、4-烯丙基苯甲醚、二氢沉香呋喃等；经香气活度值法分析辛酸乙酯是苹果酸—乳酸发酵后刺梨酒的最主要呈香物质，乙酸叶醇酯和十一烷酸赋予刺梨酒奶油乳酪香气；感官分析表明，苹果酸—乳酸发酵增加了刺梨酒的果香和乳香，降低植物气息、酸味和苦涩感。综上所述，苹果酸—乳酸发酵可通过降低刺梨酒苹果酸含量、增加乳酸含量和具有果香、乳香气味的挥发性物质含量和种类，改善刺梨酒风味、有效降低酸味、提高总体质量。关于刺梨酒苹果酸—乳酸发酵的菌种选择、接种方式、贮藏后的变化情况还需进一步研究。