不同产地裸燕麦代谢产物差异分析

代安娜 张丽媛 闵广柳 于润众

(1. 黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2. 黑龙江八一农垦大学信息与电气工程学院，黑龙江 大庆 163319)

燕麦(AvenasativaL.)是禾本科燕麦属作物，主要分为带稃型和裸粒型，具有营养价值、饲用价值和药用价值[1-2]。目前有关燕麦发酵品质、代谢产物，以及功能性成分对肠道菌群和糖脂代谢的影响等已有相关研究，肖燕子等[3]利用高效液相色谱法测定呼伦贝尔不同品种燕麦的发酵品质(丁酸、丙酸、乙酸和乳酸含量)，但未对糖类、氨基酸等代谢物进行检测；Boczkowska等[4]利用傅里叶红外光谱对波兰不同产地燕麦样品的代谢指纹图谱进行了分析，但未对代谢物的含量及差异代谢物进行分析；Loskutov等[5]使用气液相色谱—质谱研究了野生和栽培燕麦的化合物组成和总相对含量，发现栽培品种中化合物的含量波动幅度比野生品种小(在某些情况下显著)，但未利用代谢组学技术分析差异化合物；王如月等[6]利用燕麦β-葡聚糖和β-葡寡糖发酵人来源粪便，利用气相色谱仪分析发现发酵液中乙酸和丙酸含量增加；付媛等[7]研究裸燕麦球蛋白源多肽对衰老小鼠体内的抗氧化作用机制，利用超高效液相色谱质谱联用法对小鼠脑组织进行代谢组学分析；李英浩等[8]研究了干旱胁迫下腐植酸对燕麦叶片非结构性碳水化合物(NSC)代谢的影响，发现腐植酸可以通过调控燕麦叶片NSC的代谢来响应干旱胁迫。不同的代谢产物对机体代谢途径的影响也不是单一的，与传统的化学分离模式相比，代谢组学技术可以对代谢物进行定量分析，尤其是发现种间或种内的代谢物相对含量的差异，以及进一步通过非靶向代谢组学技术对代谢机制进行分析，应用在食品的产地溯源，掺假鉴别和安全风险检测等方面[9-12]。课题组[13-14]前期也对不同品种的绿豆代谢产物进行了分离鉴定，以及对来自3个产地同一品种的大豆进行了差异代谢产物及差异代谢机制分析。

研究拟将GC-MS联合代谢组学技术应用到两个不同产地裸燕麦的代谢产物分析中，对比分析样品间的差异代谢产物，并对差异代谢产物的代谢机制进行探索，以期为选择符合营养或品质要求的燕麦品种提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

河北张家口裸燕麦(HZ)和黑龙江齐齐哈尔裸燕麦(HQ)：市售；

2-氯-L-苯丙氨酸：上海麦克林生化科技有限公司；

吡啶(≥99.9%)：色谱级，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

N，O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)：上海麦克林生化科技有限公司；

甲醇：色谱级，美国Fisher技术公司。

1.1.2 主要仪器设备

气相色谱质谱联用仪(三重四级杆)：TQ8040型，配备EI离子源及AOC-5000型自动进样，日本岛津技术有限公司；

色谱柱：Rxi-5Sil型，日本岛津技术有限公司；

离心机：CR3i multifunction型，美国Fisher技术公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DGG-9140A型，上海森信实验仪器有限公司；

氮吹仪：MTN-2800D型，天津奥特塞恩斯仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样本前处理 样品经粉碎研磨均匀后，过100目筛，按四分法进一步取样，分别称取50 mg粉末于2 mL的EP管中，加入800 μL甲醇和10 μL内标(2-氯苯丙氨酸)，快速混匀1 min后，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取200 μL上清液，转入进样小瓶中用氮吹仪吹干，备用[13]。

1.2.2 衍生化处理 取30 μL甲氧铵盐酸吡啶溶液加入到浓缩后的样品中(即吹干后的小瓶)，快速混匀至完全溶解，37 ℃恒温箱放置1.5 h后取出，加入30 μL三氟乙酰胺(BSTFA)，70 ℃烘箱中放置1 h。

1.2.3 GC-MS分析

(1)GC参数：柱温80 ℃，进样口温度240 ℃，分流进样，恒定线速度控制流量，载气为氦气，柱流量1.20 mL/min，线速度40.4 cm/s，分流率15，程序升温：0～2 min，80 ℃；10 ℃/min 升到320 ℃，保持6 min，运行32 min。

(2)MS参数：离子源温度230 ℃，接口温度300 ℃，溶剂切割时间2 min，采集模式Q3 Scan，扫描范围为45～550 (m/z)。

1.3 数据处理

采用Excel软件对GC-MS数据进行统计分析，并将获得的燕麦代谢物数据与NIST 14数据库进行比较以获得结构信息并分类，研究燕麦样品的差异代谢产物。

2 结果与讨论

2.1 代谢产物的分离与鉴定

由图1和图2可知，样品中各组分分离良好，基线稳定。两个不同地区裸燕麦的总离子流图大致相似，但是在25.0～27.0 min时间段存在不同。

1.氨基戊酸 2.异丁酸 3.L-缬氨酸 4.DL-乳酸 5.L-丙氨酸 6.甘氨酸 7.甘油 8.异亮氨酸 9.L-脯氨酸 10.琥珀酸 11.富马酸 12.L-丝氨酸 13.L-苏氨酸 14.苹果酸 15.L-苏糖醇 16.3-氨基-2-哌啶酮 17.L-天冬氨酸 18.顺-4-氨基环己烷羧酸 19.左旋-谷氨酸 20.木糖醇 21.磷酸 22.丙酸 23.左旋-谷酰胺 24.β-D-呋喃果糖 25.肉豆蔻酸 26.D-葡萄糖 27.肌醇 28.D-葡萄糖酸 29.棕榈酸 30.亚油酸 31.油酸 32.反油酸 33.硬脂酸 34.花生酸 35.蔗糖 36.甘露二糖 37.纤维二糖 38.2-亚油酰甘油图1 HZ裸燕麦总离子图谱Figure 1 Total ion atlas of HZ naked oats

1.氨基戊酸 2.L-缬氨酸 3.DL-乳酸 4.L-丙氨酸 5.甘油 6.L-脯氨酸 7.琥珀酸 8.富马酸 9.L-丝氨酸 10.L-苏氨酸 11.苹果酸 12.L-苏糖醇 13.3-氨基-2-哌啶酮 14.L-天冬氨酸 15.顺-4-氨基环己烷羧酸 16.左旋-谷氨酸 17.羊毛硫氨酸 18.木糖醇 19.十八烯酸单甘油酯 20.磷酸 21.丙酸 22.左旋-谷酰胺 23.萘普生 24.β-D-呋喃果糖 25.D-呋喃果糖 26.D-松醇 27.半乳糖酸 28.吡喃半乳糖 29.L-塔罗糖 30.D-葡萄糖醇 31.β-D-呋喃半乳糖 32.棕榈酸 33.亚油酸 34.反油酸 35.油酸 36.硬脂酸 37.9-十六碳烯酸 38.D-葡萄糖醛酸 39.17-十八炔酸 40.13烯乌苏酸 41.蔗糖 42.1-单棕榈酸甘油 43.单硬脂酸甘油酯 44.β-乳糖 45.谷甾醇图2 HQ裸燕麦总离子图谱Figure 2 Total ion atlas of HQ naked oats

通过与NIST标准谱库进行对比分析，两个产地裸燕麦共检测出了56种代谢产物(HZ有38种，HQ有45种)，分为有机酸、脂肪酸、糖及其衍生物、氨基酸和中间产物。有机酸包括D-葡萄糖酸、苹果酸、氨基戊酸、异丁酸、丙酸、富马酸、琥珀酸、DL-乳酸；脂肪酸有棕榈酸、油酸、反油酸、亚油酸、硬脂酸、9-十六碳烯酸、17-十八炔酸、13-烯乌苏酸、花生酸、肉豆蔻酸；糖及其衍生物有木糖醇、β-D-呋喃果糖、D-呋喃果糖、D-葡萄糖、吡喃半乳糖、L-塔罗糖、D-葡萄糖醇、β-D-呋喃半乳糖、蔗糖、甘露二糖、纤维二糖、β-乳糖、L-苏糖醇、谷甾醇；氨基酸有L-缬氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-苏氨酸、左旋-谷氨酸、L-天冬氨酸；中间产物包括磷酸、甘油、3-氨基-2-哌啶酮、顺-4-氨基环己烷羧酸、羊毛硫氨酸、十八烯酸单甘油酯、左旋-谷酰胺、萘普生、D-松醇、肌醇、1-单棕榈酸甘油、D-葡萄糖醛酸、单硬脂酸甘油酯、半乳糖酸和2-亚油酰甘油。

2.2 相同代谢产物分析

由表1可知，两个地区的裸燕麦共有27个相同代谢产物，其中相对含量最高的是亚油酸，均在10%以上，其次是油酸(HZ 7.21%，HQ 0.49%)、反油酸(HZ 0.29%，HQ 7.11%)、氨基戊酸(HZ 5.91%，HQ 4.64%)、丙酸(HZ 4.97%，HQ 5.27%)、棕榈酸(HZ 4.97%，HQ 4.54%)、甘油(HZ 7.45%，HQ 3.63%)、蔗糖(HZ 2.63%，HQ 18.62%)、硬脂酸(HZ 1.32%，HQ 0.99%)，而其他相同化合物的相对含量均在1%以下。

表1 两样品相同代谢产物的相对含量Table 1 The same metabolites relative content

燕麦本身具有耐寒性，所以脂肪酸的含量会偏高，种类也相对较多。而其他相对含量较低的代谢产物均为中间代谢产物，主要为氨基酸和有机酸，说明燕麦中三羧酸循环较强，三羧酸循环又与糖类代谢、脂肪酸代谢、能量代谢相关，所以其相关代谢途径也会加强，从而产生对人体有益的作用[15-17]。人体中氨基酸的代谢主要包括两个方面：① 用于合成机体自身所特有的蛋白质、多肽及其他含氮物质；② 通过脱氨作用、转氨作用、联合脱氨或脱羧作用，分解成了α-酮酸、胺类及二氧化碳。由氨基酸分解生成的α-酮酸被转化为糖和脂类，或者再合成某些非必需氨基酸，也可以通过三羧酸循环被氧化成二氧化碳和水，以释放能量。有机酸参与合成酚类、氨基酸、酯类和芳香物质，以及光合作用和呼吸作用[18]。而HZ和HQ代谢产物含量不同可能是因为环境、产地及自身性质，亚油酸在HZ和HQ中含量均较高，可能是因为自身不饱和脂肪酸含量高，并且其主要脂肪酸就是亚油酸，所以含量高；而反油酸、蔗糖、甘油在HQ中含量高，在HZ中含量却很少，可能是因为燕麦是喜冷凉作物，齐齐哈尔昼夜温差大，雨量大，辐射充足，雨热同季，四季特点十分明显，另外齐齐哈尔土壤资源丰富，土地肥沃，而河北雨季、干季相当分明，并且正值雨季时，太阳辐射量会相应减少，所以在HQ中储能含量高。

2.3 差异代谢产物及代谢机制分析

2.3.1 HZ样品 HZ有11种差异代谢产物，包括2种有机酸，2种氨基酸，2种脂肪酸，3种糖类及2种中间产物，其相对含量如表2所示，2-亚油酰甘油(6.960%)相对含量最高，另外D-葡萄糖酸(1.160%)也有较高的相对含量，而其他物质均在1%以下。其中葡萄糖、甘露二糖、纤维二糖、肌醇和D-葡萄糖酸参与糖代谢，甘氨酸和L-异亮氨酸参与氨基酸代谢，肉豆蔻酸和花生酸参与脂肪酸代谢。异丁酸代谢途径未知，可能为中间代谢产物，可能是氨基酸代谢途径的中间产物，同时氨基酸代谢途径占比最大。酸为单不饱和脂肪酸，其结构不够紧密，熔点低，推测2-亚油酰甘油是油酸的代谢中间产物。河北雨季、干季分明，生长季节气候爽凉，故肉豆蔻酸、花生酸等储能代谢产物较多，另外河北属半干旱地区，年降水量为330～400 mm，水资源不足，所以进行光合作用次数较多，转化成的糖类也较多，故糖类及其衍生物较多，张家口土壤种类丰富，富含有机质和矿物质，故有机酸和氨基酸含量高，D-葡萄糖酸和异丁酸为一种有机酸，可促进三羧酸循环，加强代谢途径，甘氨酸和L-异亮氨酸可合成蛋白质。D-葡萄糖酸通过葡萄糖和UTP反应形成尿苷二磷酸葡糖(UDPG)，然后被氧化成UDP-葡糖醛酸，甘氨酸由乙醛酸与谷氨酸发生转氨反应生成，L-异亮氨酸是由L-天冬氨酸在天冬氨酸激酶作用下合成L-苏氨酸，L-苏氨酸在L-苏氨酸脱水酶作用下发生脱水反应，并进一步产生L-异亮氨酸，同时L-苏氨酸的含量受L-异亮氨酸反馈抑制[19]。

表2 HZ差异代谢产物相对含量Table 2 Relative content of HZ differential metabolites

2.3.2 HQ样品 HQ有18种差异代谢产物，包括3种脂肪酸，7种糖类及8种中间产物，其相对含量如表3所示，谷甾醇含量最高(1.420%)，其次是D-呋喃果糖和1-单棕榈酸甘油(0.700%)，其他物质含量均在0.6%以下。D-呋喃果糖、吡喃半乳糖、L-塔罗糖、β-D-呋喃半乳糖、β-乳糖、D-葡萄糖醇和谷甾醇参与糖代谢，十八烯酸单甘油酯、9-十六碳烯酸、17-十八炔酸、13-烯乌苏酸、1-单棕榈酸甘油和单硬脂酸甘油酯参与脂肪酸代谢。D-松醇参与胆固醇酯代谢循环，由乙酰辅酶A经一系列合成转变而成，半乳糖酸参与丙酮酸代谢途径，D-葡萄糖醛酸参与葡糖醛酸途径，同时脂肪酸代谢途径占比更大。脂肪酸可为燕麦提供能量，对植物本身的抗逆性起重要的作用，使其可适应寒冷的生长环境，也可在燕麦的生长过程中增强其抗旱属性。齐齐哈尔温度较低，昼夜温差大，雨热同季，辐射充足，因此燕麦代谢产物中糖类种类较多，经过光合作用或其他糖之间的相互转化及衍生形成，另外其中间产物可加强代谢，使代谢产物增多。

表3 HQ差异代谢产物相对含量Table 3 Relative content of HQ differential metabolites

HQ中检测出了羊毛硫氨酸与萘普生。羊毛硫氨酸是含硫氨基酸的一种，其结构和胱氨酸相似，它的存在也高度依赖于胱氨酸的含量。胱氨酸断开弱二硫键产生脱氢丙氨酸，后者同胱氨酸结合生成羊毛硫氨酸，脱氢丙氨酸可由丝氨酸生成，该燕麦中存在丝氨酸，故在HQ中检测出了羊毛硫氨酸。萘普生(Naproxen，NPX)化学名称为α-甲基-6-甲氧基-2-萘乙酸，是一种非甾体类抗炎药物，研究[20-22]表明地表水、地下水及饮用水中均已检测到萘普生，这对生态环境的安全构成了严重威胁。而HQ中检测出萘普生，可能是因为燕麦在生长过程中受到污染水的灌溉进而检测出萘普生。

HZ和HQ分别有5种和7种差异代谢物参与糖代谢，而HZ有2种差异代谢物参与氨基酸代谢途径，HQ有1种差异代谢物参与氨基酸代谢。HZ有3种差异代谢物参与脂肪酸代谢，HQ有6种参与该途径，此外HQ有1种差异代谢物参与胆固醇酯代谢、1种参与丙酮酸代谢、1种参与葡糖醛酸代谢。由此可以得出HQ的代谢分支途径要较HZ的多。燕麦代谢产物的不同也可能是因为外界环境的影响因素，如对环境影响的感受性、耐受性以及对环境的应激性代谢等。两种不同来源的燕麦中的代谢产物有所不同，说明产地对燕麦代谢产物具有显著影响，因此差异代谢产物可以用作产地间区分的依据。

3 结论

采用衍生的GC-MS技术对不同地区(河北张家口、黑龙江齐齐哈尔)裸燕麦中的代谢产物进行了分析。试验结果表明，在两个产地同一品种的裸燕麦中共检测出56种代谢产物，河北张家口裸燕麦的代谢产物占38种，其中有11种差异代谢产物，黑龙江齐齐哈尔裸燕麦的代谢产物占45种，其中有18种差异代谢产物。不同产地对燕麦代谢产物具有显著影响，可以利用差异代谢产物用作产地间区分的依据。试验只分析鉴定了来自两个产地同一品种燕麦的代谢产物和差异代谢产物及代谢机制，后续可以进一步利用代谢组学技术，对同一产地不同品种的燕麦，或多个产地不同品种的燕麦或其他未进行试验的粮食作物等进行代谢组学分析。