右美托咪定对脓毒症大鼠肠黏膜损伤的影响及机制

赵青，王玥，文振华，朱健，王建刚

1 山西医科大学麻醉学系，太原 030001；2 山西医科大学第一医院麻醉科

脓毒症与细胞因子风暴和包括肝脏、肠道在内的多个器官衰竭以及高病死率密切相关。肠道常被认为是危重疾病发生发展的主要场所，通过诸多不同的反馈和前馈机制驱使全身炎症反应［1］。右美托咪定（DEX）是一类已在临床工作中广泛应用的α2肾上腺素受体激动剂，其可降低危重症患者的炎性水平、减轻细胞凋亡水平，发挥潜在的肠道保护作用［2］，而DEX 对脓毒症肠黏膜屏障的靶向分子研究机制仍不完全清楚。近年来研究证实，Wnt/βcatenin 信号通路可调控细胞生长、分化、凋亡、存活和免疫功能等，其广泛参与脓毒症的发生发展［3］。2021年6月—9月，我们探讨了Dex对脓毒症大鼠肠黏膜的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：Wistar 雄性大鼠60 只，8 周龄，体质量250～300 g，术前禁食24 h，饮水不限。由山西省实验动物中心提供，所有动物按照《山西医科大学实验动物照顾与使用指南》进行，并通过山西医科大学动物伦理委员会批准。药品：DEX（每瓶0.2 mg/2 mL，批号：20032031，国药准字：H20183219），购自扬子江药业集团有限公司。材料：CRP ELISA 试剂盒与PCT ELISA 试剂盒购自CUSABIO 公司，Bcl-2 抗体、Bax 抗体、Caspase-3 抗体、Wnt1 抗体、β-catenin 抗体、GAPDH 抗体、山羊抗兔二抗均购自Proteintech公司。

1.2 动物分组及CLP 模型的建立 按随机数字表法将60只大鼠分为对照组、脓毒症组、DEX 组，每组各20 只，实验前均适应性喂养7 d。脓毒症组和DEX 组均以改良盲肠结扎穿孔法（CLP）建立脓毒症模型，参考文献［4］的方法，大鼠用异氟醚吸入麻醉，术前腹部备皮，用10%聚维酮碘清洗，行长度2 cm的腹中线剖腹手术以暴露盲肠，将盲肠紧密结扎（距盲肠尖端1 cm 处），回盲瓣远端用4-0 丝线缝合，用22 号针双重穿刺，轻轻挤压排出少量粪便，返回腹腔。然后用6-0 丝线分两层缝合开腹部位，立即用24 mL/kg生理盐水皮下注射液体复苏。对照组接受同样手术，但盲肠既不结扎，也不穿孔。DEX组在模型建立前15 min，给予40µg／kg盐酸DEX 注射液腹腔注射（8 mg/kg，5µg/mL）；对照组和脓毒组均予等体积的生理盐水腹腔注射。

1.3 回肠组织病理形态检测 采用苏木精-伊红（HE）染色法。建立CLP 模型12 h 后取各组大鼠［5］，经腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，放血，处死，间隔回盲瓣5 cm 取回肠组织，立刻将其固定于10%中性甲醛溶液中，分别经脱水、透明、包埋、切片、烤片、染色和封片等过程，最后镜检查看肠道病理改变。Chiu's病理评分分为6级［6］。

1.4 血清炎症指标降钙素原（PCT）和C 反应蛋白（CRP）检测 受试大鼠经麻醉放血后，眼眶采血0.5～1.0 mL，3 000 r/min（离心半径10 cm），4 ℃离心20 min后收集血清，分装，-80 ℃保存。严格按照PCT和CRP 的ELISA 试剂盒说明书进行稀释、加样、洗板，加入工作液后再次洗板，室温暗处反应后加入终止液，经酶标仪测吸光度值以反映PCT、CRP水平。

1.5 肠道凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3 和Wnt/β- catenin 信号通路相关蛋白表达检测 采用Western blotting 法和免疫组化法。受试大鼠经麻醉放血后，取回肠片段用生理盐水洗涤后，置入RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制剂，经充分研磨，在冰水中裂解30 min 后，12 000 r/min（离心半径10 cm）离心5 min，收集上清。用BCA蛋白浓度测定法收集样品后-80 ℃液氮保存。取蛋白样品与上样缓冲液混合煮沸变性，电泳分离，转至聚偏氟乙烯膜，室温下加入封闭液，将PVDF 膜置于孵育盒中，分别加一抗Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶5 000）、Caspase-3（1∶100）、Wnt1（1∶1 000）、β-catenin（1∶5 000），GAPDH（1∶10 000）、山羊抗兔二抗（1∶5 000），室温下孵育过夜，在ECL化学发光检测系统上显影，检测相关蛋白的灰度值。

1.6 统计学方法 采用SSPS23.0 统计软件。计量资料符合正态分布以-x±s表示，组间差异比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠回肠黏膜病理学变化 病理学检查结果显示，对照组回肠黏膜上皮无明显病理变化；脓毒症组上皮细胞明显损伤，出现固有层细胞严重结构紊乱、中央乳糜管膨胀、绒毛上皮细胞和隐窝细胞数量减少，脓毒症组与对照组Chui's 评分分别为（4.54 ± 1.34）、（0.44 ± 0.25）分，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；DEX 组Chui's 评分（0.76 ± 0.47）分，其回肠上皮组织形态与对照组相似，隐窝上皮细胞丰富，仅有少量区域的细胞间隙扩大；右美托咪定可以缓解脓毒症导致的肠黏膜损伤。

2.2 三组大鼠血清PCT、CRP 水平比较 对照组、脓毒症组、DEX组血清PCT分别为（261.16±15.23）、（1 131.41±100.75）（825.57±89.13）pg/mL，CRP 水平分别为（119.39 ± 14.43）、（842.76 ± 101.27）、（334.10 ± 50.87）ng/mL，脓毒症组血清PCT、CRP高于对照组、DEX组（P均＜0.05）。

2.3 各组大鼠回肠组织Wnt/β-catenin信号通路蛋白及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达比较 对照组、脓毒症组、DEX 组大鼠肠黏膜组织中Wnt 蛋白、β-catenin 蛋白、凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达比较，经单因素方差分析，差异有统计学意义（P均＜0.05）。进一步各组之间通过LSD-t检验两两比较，脓毒症组的Wnt 蛋白、β-catenin 蛋白、促凋亡蛋白Bax、Caspase-3 表达高于对照组和DEX 组（P均＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2 表达低于对照组和DEX组（P均＜0.05）。

表1 各组大鼠肠黏膜组织中凋亡相关蛋白及Wnt信号通路相关蛋白表达比较（xˉ±s）

3 讨论

脓毒症引起器官损伤的一个主要因素是全身和局部过度炎症［7-8］，促炎细胞因子水平过高被认为是脓毒症引起的远隔器官损伤原因之一，血清降钙素原与C反应蛋白常反映炎症的严重程度。不同信号通路相互作用导致免疫失调发生，这些信号通路被异常激活或抑制从而失去了正常的调节功能［9］。Wnt 信号通路与几乎每个层面的众多炎症通路相关，相关研究证实了Wnt 信号的促炎作用［10-12］。如敲除β-catenin 可降低NF-κB 从而降低肠道上皮细胞炎性因子的活性［13］，以及阻断Wnt/β-catenin 信号通路抑制慢性鼻窦炎小鼠模型的炎症和杯状细胞黏蛋白分泌［14］等。

细胞凋亡机制已被证明对维持组织和生物体的动态平衡至关重要，在脓毒症诱导的免疫抑制过程中，细胞凋亡在免疫细胞群的选择和功能性免疫反应的维持中起关键作用［15］。细胞凋亡可大致分为两种途径，第一种为Fas 配体和Fas 受体信号传导的死亡受体途径；第二种为受Bcl-2 家族基因及其蛋白的调控信号途径，其中Bcl 蛋白亦可分成三类，第一类为具有抗凋亡作用的Bcl-2 类生存因子，第二类和第三类分别为具有促凋亡作用的BH3 死亡因子和Bax 类死亡因子，这些信号最终导致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspase 的激活。这两种途径均参加脓毒症引起的细胞凋亡［16］。Wnt/β-catenin 信号可通过多种机制调节细胞凋亡，包括TRAIL、Caspases、Stat3、AKT、PTEN、PI3K和MAPK 通路，根据细胞或环境的不同而增强或抑制凋亡［17］。研究表明，Wnt1 蛋白与细胞凋亡过程的控制有关［18］。

DEX 目前在临床麻醉及重症医学领域应用广泛，相关研究证实，DEX 可通过多种方式减轻机体炎症反应，改善肠道细胞凋亡及肠道通透性等，发挥肠道屏障功能保护作用［19］。DEX 抑制TLR4-MyD88-NF-κB 通路，降低脓毒症大鼠体内炎性作用与细胞凋亡水平［20］。亦可通过激活胆碱能抗炎途径减少细胞因子转录抑制炎症［21］，以及PI3K/AKT 信号通路减少氧自由基生成、减轻炎症反应来实现肠道功能保护作用［22］。

本研究结果表明，DEX 改善了肠黏膜的组织病理学结构，减少了肠上皮损伤，经过DEX 治疗后DEX 组相对于脓毒症组中CRP 和PCT，以及促凋亡蛋白Bax、半胱氨酸蛋白酶Caspase-3水平降低，抗凋亡蛋白Bcl-2 水平升高，组间比较差异有统计学意义。与对照组相比，DEX 组、脓毒症组大鼠小肠组织Wnt1 和β-catenin 蛋白水平均升高，而DEX 组低于实验组，表明DEX 发挥肠保护作用可能通过Wnt经典信号传导通路。总之，本研究初步提示，DEX可能阻断肠上皮细胞中Wnt/β-catenin 的活性，通过有效地抑制脓毒症诱导的肠道过度炎性反应、细胞凋亡水平等来达到保护肠屏障功能目的。