胃癌组织中miR-200a、miR-92a表达变化与患者临床病理参数和预后的关系

郭青，赵艳争，季艳霞，卓雷，王忠瑜，孙彩云

1 邯郸市中心医院肿瘤四科，河北 邯郸 056000；2 河北工程大学附属医院整形美容科

胃癌是我国常见的恶性消化系统肿瘤，肿瘤登记数据显示我国2019 年胃癌发病人数612 821 例，粗发病率为43.1/10 万胃，胃癌死亡人数421 539例，病死率为29.6/10 万，早期胃癌无特异性症状，检出率低，患者预后较差［1］。微小核糖核酸（miRNAs）可通过与信使RNA（mRNA）结合诱导mRNA 降解，抑制蛋白翻译调整下游基因表达，调控细胞增殖分化以及凋亡，在恶性肿瘤中，多数miRNAs 表达异常，发挥致癌或抑癌基因作用［2］。现有研究显示，miR-200a 在宫颈癌［3］、上皮性卵巢癌［4］、膀胱癌［5］等多种恶性肿瘤中表达异常，与癌细胞增殖及肿瘤患者预后均有关。miR-92a 是与血管内皮细胞形成有关的miRNAs，miR-92a 表达异常与癌细胞恶性增殖分化、新生血管形成关系密切，miR-92a已被证实是结直肠癌［6］、食管癌［7］、前列腺癌［8］的潜在标志物。2017 年1 月—2018 年4 月，我们检测了104 例胃癌患者癌组织中miR-200a、miR-92a 表达，并探讨其与患者临床病理参数和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017 年1 月—2018 年4 月邯郸市中心医院收治的104 例胃癌患者，男57 例、女47 例，年龄50～71（60.23 ± 6.79）岁；肿瘤直径≥4 cm 55 例，＜4 cm 49 例；组织分化程度：低分化44例，高、中分化60 例；浸润深度：黏膜及黏膜下层34例，肌层、浆膜下及其外70 例；T 分期：T1-2期35 例，T3-4a期69例；N分期：N0期72例，N1-3期32例。纳入标准：①均接受胃癌根治手术治疗，术后病理组织学证实为胃癌；②术前未接受放化疗；③符合手术治疗指征。排除标准：①经影像学、病理学证实的其他部位原发肿瘤；②pTNM 分期Ⅲ期以上，术前接受新辅助放化疗患者或采取保守治疗者；③随访期间失去联系者。所有患者及其家属均知情同意并签署同意书。本研究通过医院伦理委员会批准（2020-1204）。

1.2 miR-200a、miR-92a 表达检测方法 手术切除的癌组织标本及癌旁（距离癌组织边缘5 cm 以上）经病理检查证实为正常胃组织，采用液氮冷冻保存。取胃癌组织及癌旁组织标本各0.2 g，采用JXFSTPRP-Ⅱ冷冻研磨机（上海净信实业发展有限公司）研磨组织，加入TRIzol试剂（美国Invitrogen生命技术公司）提取组织中总RNA。采用Multiskan SkyHigh全波长酶标仪（美国赛默飞公司）选取OD260/OD280为1.8～2.0 样本，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（美国赛默飞公司）将RNA 逆转录为cDNA。取2 µL cDNA 样品加入RT-qPCR 反应体系，CFX96实时定量PCR 系统（美国BIO-RAD 公司）进行PCR扩增和基因表达分析。反应体系包括PrimeScript RT Enzyme Mix1 1.0 µL，RT Primer Mix 1.0 µL，5×PrimeScript Buffer 2 4.0 µL，RNase Free dH2O 4.0 µL，cDNA 模板2 µL，正反向引物各1 µL，加水至20µL。扩增条件：95 ℃预变性3 min，98 ℃变性2 s，67 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循环30 次，每个循环延伸时间递增1 s，最后72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。引物设计由金斯瑞生物科技公司合成。miR-200a 正向引物：5′-GAGGATGAT TGCTGACGTGGA-3′，反向引物：5′-TCl CAGATGGTGAGCGAG-3′，扩增片段长度113 bp。miR-92a正向引物：5′-AGCTCTACGACTGTCACTCG-3′，反向引物：5′-GTATGCATTCTATCGTAG-3′，扩增片段长度108 bp。U6（内参）正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。取PCR 扩增产物，2%琼脂糖凝胶电泳30 min，DYCZ-30C 双板夹芯式垂直注塑电泳仪进行凝胶成像分析。2-ΔΔCt法计算miR-200a、miR-92a 相对表达量。

1.3 随访 胃癌患者出院后均定期电话随访，术后第1年每3个月随访1次，术后第2年每6个月随访1次，随访3 年。统计随访期间胃癌患者总生存和无瘤生存情况，总生存时间为自病理确诊到全因死亡或随访结束时间，无瘤生存时间为自病理确诊到肿瘤复发和远处转移、全因死亡或随访结束时间。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。Kolmogorov-SmiRnov 法检验miR-200a、miR-92a 拟合优度，符合正态分布计量资料以-x±s表示，比较采用独立样本t检验。Kaplan-Meier 生存分析不同miR-200a、miR-92a 表达胃癌患者生存情况，Log-Rank检验比较生存率差异，Cox回归分析影响胃癌患者生存的危险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织和癌旁组织中miR-200a、miR-92a 表达比较 胃癌组织和癌旁组织中miR-200a 相对表达量分别为1.49±0.47、3.19±1.07，miR-92a 相对表达量分别为2.93 ± 0.48、1.24 ± 0.30，胃癌组织中miR-92a 表达高于癌旁组织（P＜0.05），miR-200a表达低于癌旁组织（P＜0.05）。

2.2 胃癌组织中miR-200a、miR-92a 表达与患者临床病理参数的关系 浸润至肌层、浆膜下及其外、T3-4a期、N1-3期胃癌患者癌组织中miR-200a 表达低于浸润至黏膜及黏膜下层、T1-2期、N0胃癌患者（P均＜0.05），miR-92a 表达高于浸润至黏膜及黏膜下层、T1-2期、N0期胃癌患者（P均＜0.05）。不同年龄、性别、肿瘤直径、组织分化程度miR-200a、miR-92a 表达比较无统计学差异（P均＞0.05），见表1。

表1 胃癌组织中miR-200a、miR-92a表达与患者临床病理参数的关系

2.3 miR-200a、miR-92a 表达与胃癌患者生存的关系 随访期间胃癌死亡33 例，复发和远处转移12例。Kaplan-Meier 生存分析结果示miR-200a＜1.49（56例）胃癌患者3年总生存率为58.93%（33/56），3年无瘤生存率为44.64%（25/56），低于miR-200a≥1.49（48 例）胃癌患者的79.17%（38/48）、70.83%（34/48），miR-92a≥2.93（57例）胃癌患者3年总生存率为61.40%（35/57），3 年无瘤生存率为45.61%（26/57），低于miR-92a＜2.93（47 例）胃癌患者的78.72%（37/47）、70.21%（33/47）（Log-Rankχ2miR-200a 分别为5.177、8.089，P分别为0.023、0.005；Log-Rankχ2miR-92a 分别为3.990、8.392，P分别为0.046、0.004）。

2.4 影响胃癌患者预后的Cox 回归分析 单因素Cox 比例风险回归分析结果显示，T 分期、N 分期、miR-200a＜1.49、miR-92a≥2.93 与胃癌患者预后有关（P均＜0.05），见表2。多因素Cox 比例风险回归模型结果显示，N 分期、miR-200a＜1.49、miR-92a≥2.93是胃癌患者不良预后的危险因素（P均＜0.05），见表3。

表2 影响胃癌患者预后的单因素Cox比例风险回归分析

表3 影响胃癌患者预后的多因素Cox比例风险回归分析

3 讨论

胃癌是全球第五大常见癌症和第三大癌症死亡原因，幽门螺杆菌感染、年龄、高盐摄入量、水果和蔬菜摄入量低是胃癌发病的高危因素。胃癌早期以上腹不适、反酸、嗳气、食欲减退等非特异性症状为主，易与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病混淆，早期检出率低，多数患者确诊即晚期，生存率低［9］。miRNAs 是广受关注的新型小分子非编码RNA，通过抑制mRNA 翻译或促进mRNA 降解在转录后水平调节基因表达，参与恶性肿瘤、心血管疾病、代谢疾病在内的多种疾病病理过程［10］。现有研究显示，多种miRNAs参与胃癌的发病和进展过程［11-12］。

miR-200a 是上皮表型的关键调节因子，位于1号染色体，主要表达于细胞间质及细胞器周边，可靶向E-钙黏蛋白转录抑制因子E 盒锌指蛋白1、Smad相互作用蛋白1 调控上皮间质转化和肿瘤侵袭转移［13］。研究显示，miR-200a 在乳腺癌中通过抑制致癌基因—去乙酰化酶沉默信息调节因子2 相关酶1表达抑制乳腺上皮间质转化过程［14］。miR-200a 在宫颈癌组织和细胞系中表达上调，高表达miR-200a可上调缺氧诱导因子1-α 和血管内皮生长因子表达促进卵巢癌细胞增殖、集落形成和侵袭［3］。miR-200a 被认为是浸润性膀胱癌侵袭的正向调节因子，miR-200a 通过抑制miR-16 表达，上调c-Jun 氨基末端激酶2 表达，基质金属蛋白酶-2 转录，最终导致浸润性膀胱癌侵袭和转移［15］。本研究结果表明，miR-200a 在胃癌组织中表达下调，miR-200a 低表达与胃癌浸润深度、T 分期、N 分期均有关，这与miR-200a 在乳腺癌［14］的作用机制一致，但与宫颈癌、膀胱癌［3，15］的作用机制相反，说明miR-200a 在不同恶性肿瘤中可能发挥不同作用。基础研究显示，miR-200a 过表达可抑制肿瘤坏死因子-α 诱导蛋白3表达和受体相互作用蛋白激酶1泛素化，促进半光天冬酶-8 裂解，肿瘤坏死因子-α 相关的凋亡诱导配体激活，引起胃癌细胞凋亡［16］。miR-200a-3p还可通过与Kruppel 样转录因子12 的3'-UTR 区结合抑制Kruppel 样转录因子12 表达，使细胞周期停滞于G1/S 期，抑制胃癌细胞增殖和迁移，促使胃癌细胞凋亡［17］。由此可见在胃癌中miR-200a 可能发挥抑癌基因作用，miR-200a 表达缺失可能是胃癌恶性进展的原因之一。通过随访发现，miR-200a 低表达与胃癌患者低生存率有关，miR-200a 低表达是胃癌患者术后生存率低下的原因，提示miR-200a 可以作为胃癌预后评估的参考指标。

miR-17～92 基因簇位于染色体基因座13q31.3，编码miR-92a、miR-17、miR-18a、miR-19a/b、miR-20a，其中miR-92a是目前研究最多的miRNAs 之一，可调控心、肺、免疫系统等器官发育及血管形成过程，在恶性肿瘤中，miR-92a 可促使肿瘤细胞增殖，抑制肿瘤细胞凋亡，提高肿瘤细胞侵袭和转移能力，在肿瘤进展中发挥致癌基因作用［18］。miR-92a 在结直肠癌组织中表达上调，通过直接靶向抑制抑癌基因-RECK表达，上调基质金属蛋白酶表达，促使癌细胞侵袭和转移［19］。miR-92a-3p 可通过Toll 样受体7/8 依赖性方式刺激肿瘤相关巨噬细胞分泌白细胞介素-6，促进脂肪肉瘤细胞增殖、侵袭和转移［20］。miR-92a-3p还可通过调控EGFR、K-RAS和PI3K/AKT信号传导，参与肺腺癌和肺鳞癌发病和进展［21］。本研究发现，胃癌组织中miR-92a 表达升高，miR-92a 表达与胃癌浸润深度、T分期、N分期有关，说明miR-92a过表达与胃癌发生及恶性侵袭行为有关。miR-92a 参与胃癌的发病机制：Kruppel样转录因子2可抑制肿瘤发生，促使肿瘤细胞凋亡，是miR-92a-3p的直接靶标，miR-92a-3p通过靶向抑制Kruppel样转录因子2 表达，促进胃癌细胞的增殖和侵袭［22］。其次，F 框/WD-40 域蛋白7（FBXW 7）是一种抑癌基因，FBXW 7 过表达可抑制癌细胞增殖，促使癌细胞凋亡，miR-92a 可靶向抑制FBXW 7 促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭，并减少胃癌细胞凋亡［23］。因此，miR-92a 过表达可能促使胃癌细胞恶性增殖以及侵袭和转移，在胃癌发病机制中发挥促癌基因作用。生存和回归分析结果显示，miR-92a与胃癌患者术后生存有关，miR-92a高表达是胃癌患者预后不良的危险因素，提示miR-92a是胃癌患者预后评估的潜在指标。REN 等［24］认为，miR-92a 是胃癌患者生存期缩短的重要预测因子。

miR-200a、miR-92a 在胃癌发病和进展过程中是否存在相互作用仍不清楚，但两者均与胃癌浸润深度、T 分期、N 分期和生存率有关，说明miR-200a、miR-92a 可能共同参与胃癌发生发展。本研究选择miR-200a、miR-92a 两个指标原因为单个指标不能反映胃癌病情进展，综合两个指标可以更全面判断病情进展方向，为预后评估提供更可靠指导。

综上所述，胃癌组织中miR-200a 表达下调，miR-92a表达上调，miR-200a、miR-92a 可作为胃癌病情分析和预后评估的潜在指标。本研究不足之处在于只检测了早期根治术患者的数据，对于晚期胃癌miR-200a、miR-92a 表达特点，其与晚期胃癌恶性指标和预后的关系尚不清楚，仍需进一步研究探讨。