进境百合种球上3种线虫的检疫鉴定研究

杨小凤 祝秀丽 陆辰晨 邵沛泽 谌运清 赵光明 杨万风 汪连军 潘 杰

（连云港海关，江苏连云港 222042）

近年来，我国花卉产业不断发展壮大，百合、郁金香等广受人们喜爱。江苏口岸在全国花卉种苗进口方面占有举足轻重的地位，其进境花卉种球主要来源于荷兰，多为百合、郁金香、风信子和洋水仙等，品种繁多。花卉种球以活体形式进行贸易与运输，为保持种球活性，进境时一般带有根和栽培介质。线虫分布广泛，生存和繁殖能力非常强[1]，在种球及介质土中能够长期存活并难以彻底清除。2020年，连云港口岸从进境百合种球中检出多种线虫，其中洞穴长尾线虫（Seinura caverna）、毁芽滑刃线虫（Aphelenchoides blastophthorus）和燕麦真滑刃线虫（Aphelenchus avenae）为江苏口岸首次截获。本文主要对上述3种线虫进行检疫鉴定，以期为进境花卉种球检疫监管提供参考。

1 材料与方法

1.1 线虫分离

采用改良贝曼漏斗法，取约100 g剪碎的百合种球或介质土，用双层纱布包裹，轻轻放入盛有水的漏斗中（避免液体浑浊），以水刚好浸透样品为宜。25℃左右静置24 h，用凹面皿接取线虫液约10 mL，在ZEISS Discovery.V8体视显微镜下进行镜检。

1.2 形态学鉴定

在体视显微镜下挑取目标线虫至载玻片，热杀死后制成临时玻片，在ZEISS Imager.A2显微镜下进行形态特征观察及拍照。将线虫液收集到离心管中，用4%甲醛杀死固定后，采用甘油－乙醇快速脱水法[2]对线虫进行脱水并制作永久玻片，在显微镜下进行形态特征观察及拍照，利用de Man公式进行形态测计[3]。 包括体长、体长/最大体宽（a）、体长/头顶至食道腺和肠连接处距离（b）、体长/头顶至食道腺末端距离（b′）、体长/尾长（c）、尾长/肛门处体宽或泄殖腔处体宽（c′）、头顶至阴门处距离/体长（V）、口针长度、尾长和交合刺长度等指标。

1.3 分子生物学鉴定

挑取单条线虫放入ddH2O中清洗，去除表面杂质。用单条线虫DNA快速提取试剂盒（百川生物）提取线虫基因组DNA，获取DNA提取液直接进行PCR扩增。核糖体DNA（rDNA）的28S D2/D3区扩增引物对为 D2A（5′－ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG－3′）和 D3B（5′－TCGGAAGGAACCAGCTACTA－3′）[4]，由南京金斯瑞合成。PCR反应体系（25 μL）为线虫DNA模板 1 μL、5 μmol/L 的上游引物和下游引物各 2 μL、2×Ex Taq Mix 12.5 μL、ddH2O 7.5 μL。 反应程序为94℃预变性 3 min，94℃变性 30 s，54℃退火 40 s，72℃延伸1 min，36个循环，72℃延伸8 min。将扩增产物送至南京思普金生物科技有限公司测序，所获得拼接序列提交NCBI数据库进行比对。

2 结果与分析

2.1 洞穴长尾线虫

分类地位：真滑刃总科（Aphelenchoidea）滑刃科（Aphelenchoididae）长尾亚科（Seinurinae）长尾属（Seinura）[5]。

2.1.1 形态特征描述。雌虫形态特征如图1所示：热杀死后，洞穴长尾线虫雌虫向腹面弯曲，头部较高，缢缩明显，口针纤细，无口针基部球，基部稍膨大；食道前体部长筒形，中食道球发达，长椭圆形，近体宽，瓣门明显，位于中食道球中后部；排泄孔位于中食道球基部前方；食道腺长叶状，从背面覆盖肠；阴门位于虫体中后部，横裂，阴道稍向前倾斜；单生殖腺，卵巢前伸，有后阴子宫囊；肛门明显，尾部较长，丝状。雄虫未见。

测计值及文献比较见表1。与Kanzaki等[6]的描述值相比较，本文雌虫的体长及尾长均略短，分别为（746.1±19.9）μm（变化范围为 726.0～772.1 μm）、（102.5±7.8）μm（变化范围为 95.1～113.2 μm）；其他测计值基本相符。

表1 洞穴长尾线虫测计值及文献比较

2.1.2 分子生物学特征分析。PCR扩增获得一条长度为756 bp的28S D2/D3区DNA序列。BLAST比对结果表明，该序列与GenBank中已登录的S.caverna（LC414971）序列相似性达100%。

2.2 毁芽滑刃线虫

分类地位：真滑刃总科（Aphelenchoidea）滑刃科（Aphelenchoididae）滑 刃 亚 科 （Aphelenchoidinae）滑刃属（Aphelenchoides）[5]。

2.2.1 形态特征描述。如图2所示：雌虫热杀死后向腹面弯曲，体表具环纹，侧线4条；唇区缢缩明显，唇区宽约为唇高2倍；口针长约13 μm，基部球明显；中食道球卵圆形，肌肉组织发达，近体宽，瓣门骨化明显，新月形；食道峡部短，神经环位于中食道球后约1个中食道球长度位置；食道腺叶状，背面覆盖肠端；单卵巢，前伸，卵母细胞单列，有后阴子宫囊，长度为肛阴距的1/2～2/3；阴门位于虫体中后部，V值约为68%；尾圆锥形，尾长约为肛门处体宽的3倍，尾端具单尾尖突。雄虫形态特征与雌虫相似，但体长普遍比雌虫短；交合刺呈玫瑰刺状，具基顶和喙突；无引带和交合伞；尾形与雌虫相似，具单尾尖突。

测计值及文献比较见表2和表3。与Consoli等[7]和Franklin等[8]的描述值相比较，本文雌虫a值较小，为 25.4±0.9（变化范围为 24.2～26.4），阴门位置略靠前，V 值为 67.9%±0.9%（变化范围为 66.8%～69.0%），其他测计值基本相符。本文雄虫体长略高于Consoli等[7]的描述值，低于Franklin等[8]的描述值，体长为（689.0±65.6）μm（变化范围为 606.3～771.2 μm）；a值、口针及交合刺长度与Consoli等[7]的描述相似，均低于Franklin等[8]的描述值；其他测计值基本相符。

表2 毁芽滑刃线虫雌虫测计值及文献比较

表3 毁芽滑刃线虫雄虫测计值及文献比较

2.2.2 分子生物学特征分析。提取雌虫DNA，PCR扩增获得一条长度为733 bp的28S D2/D3区DNA序列，BLAST比对结果表明，该序列与GenBank中已登录的A.blastophthorus（MK981894）序列相似性达98%。

2.3 燕麦真滑刃线虫

分类地位：真滑刃总科（Aphelenchoidea）真滑刃科（Aphelenchidae）真滑刃亚科（Aphelenchinae）真滑刃属（Aphelenchus）[5]。

2.3.1 形态特征描述。雌虫形态特征如图3所示：热杀死后稍向腹面弯曲，头部低平，口针较细，无基部球；中食道球大、近方形，直径近体宽，食道球瓣门发达，食道峡部较短；食道腺叶状，从背面覆盖肠端；雌虫阴门位置较后，阴门横裂，阴门唇有时略突起，单生殖腺，卵巢前伸，后阴子宫囊长度超过肛阴距的1/2；肛门前唇略突起；尾短，稍向腹面弯曲，末端钝圆或宽圆。雄虫未见。测计值及文献比较见表4，与Goodey等[9]和李星月等[10]的描述值相比较，本文雌虫阴门位置略靠后，头至阴门距离/体长V值为77.1%±1.6%（变化范围为 74.6%～78.8%）；且尾长略短，尾长为（24.0±4.02）μm（变化范围为 18.9～33.5 μm）；其他测计值基本相符。

表4 燕麦真滑刃线虫雌虫测计值及文献比较

2.3.2 分子生物学特征分析。PCR扩增获得一条长度为707 bp的28S D2/D3区DNA序列，BLAST比对结果表明，该序列与GenBank中已登录的A.avenae（KP313838）序列同源性达98%。

3 结论与讨论

随着外来花卉种球进境的线虫种类繁多，口岸人员关注检疫性植物寄生线虫的同时，也面临着数量及种类更为庞大的非检疫性线虫检疫，此类线虫的潜在性危险不容忽视。因此，准确判断线虫种类，对提高口岸线虫检疫水平、加强口岸进境花卉种球风险分析至关重要。近年来，随着实验室检测能力的提升，连云港口岸截获线虫种类及数量明显上升，本文所描述3种线虫均为江苏口岸首次截获。

长尾属线虫广泛分布于世界各地，是一类食性较广的捕食性线虫，主要存在于土壤中，具有维持土壤线虫种群动态平衡的作用，在枯死的松树中也常被发现[11]。长尾线虫属是一类形态学研究还不太完善的类群，在迄今已报道的44个有效种中，绝大部分种类仍然存在特征描述不完善的问题[12]。洞穴长尾线虫（S.caverna）在连云港口岸进境百合种球检疫中多次截获，主要存在于百合种球随附的介质土中，国内现有报道对洞穴长尾线虫的研究较少，其形态特征描述有待完善，有无致病性也有待进一步研究。

我国对外公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中，滑刃属线虫只有草莓滑刃线虫（Aphelenchoides fragariae）、菊花滑刃线虫（Aphelenchoides ritzemabosi）。 毁芽滑刃线虫（A.blastophthorus）最早在英国发现，国内现有报道较少。有研究表明，毁芽滑刃线虫能够引起山萝卜属植物叶片卷曲、花序减少，对草莓也具有潜在破坏力[8]。因此，在进境线虫检疫中应给予足够重视。

燕麦真滑刃线虫（A.avenae）在世界各地均有分布，美国、法国、中国、意大利、印度、加拿大、菲律宾等国都有报道，是一类食真菌线虫，也可取食植物，寄主范围十分广泛[13]。有研究表明，燕麦真滑刃线虫对土壤氮矿化、植物生长及真菌生长有影响，但其作用与土壤生态系统存在复杂的相互关系[14]。燕麦真滑刃线虫在进境百合种球检疫中频繁截获，对种球生长有无不利影响有待进一步研究。