牛羽虱的形态学特征和分子鉴定

粟玉刚，李向勇，李 蜜，陈宇明，谭镜明

（1.长沙市农业综合行政执法局，湖南长沙 410013；2.长沙生态动物园，湖南长沙 410118）

牛羽虱（Bovicola bovis，B.bovis）是一类寄生于牛体表的专性外寄生虫，隶属于节肢动物门（Arthropoda）昆虫纲（Insect）翅亚纲（Pterygota）虱目（Phthiraptera）丝角亚目（Ischnocera）兽羽虱科（Trichodectidae）牛羽虱属（Bovicola）。牛羽虱是一类非常普遍且具有临床意义的体外寄生虫[1]，给畜牧业造成了一定经济损失。据报道[2]，英国每年由其导致的损失高达2 000 万英镑。牛感染牛羽虱后表现为瘙痒和擦伤，严重者大量脱毛，出现皮肤创伤和感染[3]。除了体表可见的伤害外，牛羽虱还会造成斑点类隐藏损伤[4]。该病传染性较强，如果牛群里有一头牛患病，在短时间内就会传遍整个牛群。牛羽虱对牛的正常生长和活动带来了严重损害和影响，但该病常常被养殖户忽视[5]。牛羽虱虽然是一类常见寄生虫，但很少有相关研究报道，因此准确鉴别牛羽虱不仅对该病防控具有重要意义，而且具有重要的学术价值。

线粒体基因组是近年来分子生物学领域最常用的分子标记之一，因其具有结构简单、缺少重组、呈母系遗传、进化速率快等特点[6-8]，已经被广泛应用于虱子分类鉴定、系统发育和分子进化分析等领域[9-11]。线粒体基因组中的细胞色素c 氧化酶第I 亚基（cytochrome c oxidase subunit 1，cox1）基因是理想的分子遗传标记。本研究采集来自湖南省长沙市黄牛体表的虱子，基于初步的形态学观察后，对虫体的cox1基因进行扩增、测序和序列分析，以期为牛羽虱的分类鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 3 只虱子样品采集自湖南省长沙市某黄牛养殖场。

1.1.2 主要试剂 Wizard®SV Genomic DNA Purification System（DNA 提取试剂盒），购自美国Promege 公司；Proteinase K（蛋白酶K，20 mg/mL）、Nuclease-free Water（无核酸酶水）、无水乙醇，购自北京全式金生物公司；PremixTaq™（混合聚合酶），购自TaKaRa 公司；Bioweste regular agarose G-10（普通琼脂糖）、GelstainRedTM（核酸染料），购自US EverBright 公司。

1.1.3 主要仪器设备 S1010E 小型离心机、SCIVS 小型涡旋震荡仪，购自Scilogex 公司；5427 R Centrifuge 高速离心机，购自Eppendorf 公司；三温三控水浴锅，购自上海精宏实验设备有限公司；全自动样品快速研磨仪，购自上海净信实业发展有限公司；电子秤，购自Sartorius 公司；DYY-6C 型电泳仪，购自北京六一生物科技有限公司；Quantum VilBer LouRMAT 紫外凝胶成像系统，购自北京五洲东方科技发展有限公司；Applied biosystems®2720 Thermal Cycler PCR 扩增仪，购自上海艾研生物科技有限公司；Nikon SMZ18 体视显微镜，购自湖北上光仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 虫体采集 在黄牛体表翻开被毛，用镊子采集虱子样品，以生理盐水反复冲洗后，保存于酒精内，置-40 ℃备用。

1.2.2 形态学观察 取出存放于酒精内的虫体样本若干只，使用体视显微镜分别对虫体背面、腹面进行形态学观察并拍照。

1.2.3 虫体总DNA 提取 取3 只虫体样本，将虫体分别放入灭菌1.5 mL Eppendorf 离心管中，用超纯水反复冲洗5 次后，使用研磨机研磨，然后根据Wizard®SV Genomic DNA Purification System（DNA 提取试剂盒）说明书提取DNA，将提取的DNA 样品置于-20 ℃保存备用。

1.2.4 引物合成 参照Hafner 等[12]报道的虱子cox1基因序列通用引物（L6625：5'-CCGGATCCT TYTGRTTYTTYGGNCAYCC-3'；H7005：5'-CCG GATCCACNACRTARTANGTRTCRTG-3'），由 上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2.5 PCR 扩增 以提取的虫体总DNA 为模板，使用上述合成的引物进行扩增。反应总体系25.0 µL：PremixTaq™ 12.5 µL，Nuclease-free Water 10.5 µL，上下游引物各0.5 µL，模板1.0 µL。反应条件：94 ℃预变性1 min；98 ℃变性10 s，45 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 个循环；最后72 ℃再延伸2 min。取5.0 µL PCR 产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，电泳仪设置电压120 V、电流100 mA，用核酸染料染色，在紫外透射仪下观察结果并拍照。

1.2.6 序列测定及系统发育分析 将阳性PCR产物送至北京擎科生物科技有限公司测序。对测序结果使用DNAMAN 软件拼接好后，提交至NCBI 进行Blast 对比。从GenBank 下载部分兽羽虱科现有的cox1序列（表1），以长角羽虱科的草原雕虱（Falcolipeurus suturalis，基因登录号MW696813）作为外群，利用Mega 5.0 软件中最大似然法（maximum likelihood method），采用GTR模型构建羽虱的cox1序列系统发育树，使用自举检验（bootstrap=1 000）估算所构建发育树的可靠性。

表1 基于cox1 序列构建的系统发育树中包含的羽虱物种

2 结果

2.1 形态学观察

在体视显微镜下观察可发现：虫体平均大小为7.5 mm×3.0 mm。虫体头部呈钝圆的三角形，在头部中央有1 对细长的触角；胸部有3 对足，由基节、胫节、跗节和爪组成；腹部由8 节组成，各节的背面和腹面有硬化的几丁质片，腹部的两侧边也可以观察到片形的硬化片，气门存在于此；体表有许多细小的针形刚毛（图1）。

2.2 PCR 扩增

PCR 扩增结果（图2）显示，3 个虫体DNA样本均能成功扩增出大小约400 bp 的片段，与预期目的片段长度相符，且无非特异性杂带，空白对照为阴性。

2.3 测序结果及分析

3 个虱子虫体样本cox1序列长度相同，均为400 bp。在删除引物序列和低质量序列后，得到长度为389 bp 的序列片段。Blast 结果显示，3 个样本cox1序列与GenBank 收录的牛羽虱（登录号MH001191）序列相似性为99.0%～99.5%，说明本次采集虱子属于牛羽虱。

2.4 cox1 基因序列系统发育树构建

基于cox1基因序列构建的系统发育树显示，采集自湖南省长沙市的牛羽虱与GenBank 收录的牛羽虱（登录号MH001191 和AF545680）均位于同一大分支（图3），且与山羊羽虱亲缘关系更近，与犬毛虱亲缘关系最远，这与之前的研究结果[11]一致。系统发育关系进一步验证了本研究的3 个样本属于牛羽虱。

3 讨论

对寄生虫进行准确鉴定是防控寄生虫病的基础。寄生虱一般有宿主特异性，如寄生在牛的羽虱仅有牛羽虱，寄生在山羊的羽虱为山羊羽虱和屈缘羽虱，寄生在绵羊的羽虱仅有绵羊羽虱。本研究采集的虱子虫体平均大小为7.5 mm×3.0 mm，头部钝圆，中央处有一对细长触角，体表有刚毛，腹部有硬化片。根据世界羽虱名录及其宿主特异性，初步鉴定该虱子样品为牛羽虱[13]。然而，因为牛羽虱、山羊羽虱、屈缘羽虱和绵羊羽虱的形态学特征非常相似，所以单靠形态学很难对这些羽虱进行准确区分和鉴定，而分子生物学技术很好地解决了这一问题。

线粒体基因组是近年来分子生物学研究的重点之一。根据线粒体基因组中cox1基因具有种内保守、种间差异性较大的特点，其在寄生虫的分类鉴定和种群遗传方面被认为是非常理想的遗传标记[14-16]。本研究获得的3 个样本株序列与GenBank收录的牛羽虱（登录号MH001191）cox1序列相似性高达99.0%～99.5%，系统发育关系也显示与牛羽虱均处于同一分支，进一步证明本研究样本株为牛羽虱。该结果为准确鉴定牛羽虱奠定了基础，也进一步说明将线粒体cox1基因作为羽虱的分类鉴定遗传标记具有一定意义。