双向电泳指纹图谱分析法鉴别鲜乳和复原乳

王海艳，李 昕，石新华，蒙 嵘，李凤利，张小玲，盛万里

（1.呼和浩特海关，内蒙古呼和浩特 010020；2.内蒙古自治区农牧业技术推广中心，内蒙古呼和浩特 010010）

复原乳是将无水奶粉和水混合加工处理后制成的液体乳，其成分因多次高温处理而受到破坏，导致部分蛋白、生物活性成分和免疫因子消失，因此可以基于这些特点，利用区分蛋白的技术手段，将复原乳与鲜乳区分开来。双向电泳技术（2DGE）是目前分辨率最高、唯一可同时分离上千种蛋白质的方法。该技术利用蛋白质等电点和相对分子质量的不同分离蛋白质：首先依据等电点不同，将不同净电荷的蛋白质进行分离，然后再依据相对分子质量的不同通过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同蛋白点进行分离。因此，2DGE 是一种宏观、可量化的技术手段，具有分辨能力强、重现性好等优点，被广大科研工作者用于科学研究[1]。该技术过去曾用于中药材真伪鉴别[2]，并得到美国食品药品管理局和世界卫生组织的认可[3-4]。近年来，我国也将该方法应用于食品过敏原研究并取得满意结果[5-6]。本研究探讨采用2DGE 对鲜乳和复原乳进行真伪鉴别的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 乳及乳粉样本 鲜乳，采集于内蒙古呼和浩特市郊区某奶牛养殖场；巴氏乳、乳粉以及巴氏处理的复原乳，购于某大型超市。

1.1.2 主要试剂 7 cm、17 cm ReadyStrip（pH3.0～10.0、3.9～5.1、4.0～7.0、4.7～5.9、5.5～6.7）胶条，IPG 缓冲液（pH3.0～10.0、3.9～5.1、4.0～7.0、4.7～5.9、5.5～6.7），2DGE 相关试剂，购自美国BIO-RAD 公司；BCA Protein Assay kit 蛋白定量试剂盒，购自美国Novagen 公司。

1.1.3 主要设备 2DGE 系统和蛋白扫描仪，购自美国BIO-RAD 公司。

1.2 方法

1.2.1 牛乳样品双向电泳条件选择 将原乳样品常温下1 500g离心20 min 后，去除上层脂肪，测定蛋白质质量浓度后备用；按照2DGE 系统和胶条使用说明书进行第一向和第二向电泳，电泳结束后先用考马斯亮蓝染色，再用蛋白扫描仪扫描图像。

1.2.1.1 第一向等电聚焦 取出冷冻保存的水化上样缓冲液1 mL 置室温溶解，在管中加入0.01 g DTT 和5 μL Bio-Lyte 后混匀，然后各取500 μL 分别加入4、6、8、10 μL 乳样并混匀；取出冷冻保存的不同pH 的7 cm 和17 cm IPG 预制胶条，置室温10 min，沿水化盘中槽的边缘从左至右加入样品，再将IPG 胶条胶面朝下置于水化盘中样品溶液上；在每根胶条上覆盖2 mL 矿物油；盖上盖子，按等电聚焦程序进行分离。等电聚焦后立即进行平衡和第二向SDS-PAGE 电泳，如果不能及时进行下一步实验，则置于-70 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 第二向SDS-PAGE 电泳 配制10%的丙烯酰胺凝胶2 块；从-20 ℃冰箱中取出胶条，于室温放置10 min，使其溶解，按照操作说明书要求将胶条进行平衡后将其浸在1×电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在有凝胶的长玻璃板上；将放有胶条的SDS-PAGE 凝胶转移到灌胶架上，在凝胶上方加入低熔点琼脂糖封胶液，用镊子轻轻向下推胶条，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触，待彻底凝固后进行电泳；电泳结束后再进行染色。

1.2.2 不同牛乳样品双向电泳比较 将采集于某奶牛场的新鲜乳去除上层脂肪自制成原乳、巴氏乳和超高温瞬时灭菌乳（UHT 乳），将乳粉制成巴氏处理的复原乳。将这4 种样品调整为总蛋白量基本一致，参照1.2.1 的方法电泳、染色和蛋白分析。

1.2.3 实际样品检测 采用pH4.7～5.9 的17 cm胶条，对市场上购买的巴氏乳以及巴氏处理的复原乳进行电泳分析，方法同1.2.1。

2 结果与分析

2.1 牛乳样品双向电泳条件选择

以脱脂原乳为样品，选择不同pH 的7 cm 和17 cm 胶条进行比较。结果（图1）可见：牛乳的主要蛋白点都集中在pH4.0～7.0 范围内，pH4.7～5.9和pH4.0～7.0 的胶条等电聚焦后均能够有效区分蛋白点，但是pH4.7～5.9 蛋白点最清晰，且17 cm 比7 cm的胶条蛋白点更清晰，比较适合牛乳蛋白电泳。

2.2 不同牛乳样品2DGE 比较

将原乳、巴氏乳、UHT 乳、巴氏处理复原乳4 种样品调整为总蛋白量基本一致后进行2DGE 试验。结果（图2）显示：随着热处理强度的增加，蛋白点着色变浅。通过软件分析，将参数设置为巴氏乳蛋白含量比复原乳高2 倍以上时，有10 个蛋白点满足该条件（图3）。

2.3 实际样品检测

为进一步验证该鉴定技术的可行性，对市售的几种巴氏乳和复原乳产品进行分析，结果发现巴氏乳图谱与自制参照乳图谱基本一致，而复原乳蛋白点明显变少，着色变淡甚至模糊（图4）。

3 讨论

与鲜乳相比，复原乳的营养作用有所降低。国务院办公厅在《关于加强液态乳生产经营管理的通知》中明确要求，复原乳生产商必须在产品包装上明确标注“复原乳”字样。但仍有部分复原乳生产企业未按要求进行标注，因此急需建立有效检测方法开展市场监管工作，以保证乳品市场健康发展。

2DGE 主要应用于蛋白领域的研究工作，包括总蛋白、不同蛋白质差异表达和蛋白修饰等，通过与标准蛋白比对，即可获得检测蛋白的等电点和相对分子质量等相关信息，从而建立有效的数据库。该技术已被广泛应用于医学领域。例如，通过斑点对比可检测到差异蛋白，从而发现引起疾病的相关蛋白，并可查找到诊断疾病的相关标记因子，也可通过查找与疾病相关的蛋白药靶，用于疾病致病机理研究等[7]。

目前最常用的蛋白染色方法是考马斯亮蓝染色法和银染法：考马斯亮蓝染色具有操作简便、毒性低和重复性好等优点而被广泛使用[8]，但其灵敏度低，导致低丰度蛋白难以显现；银染法是非放射性染色法中最灵敏的方法，但存在脱银方法复杂、重复性差等缺点使其使用受限[9]。目前，有研究者正积极探索更适合区分乳中蛋白的染色方法，例如荧光染色、同位素标记、负染法等。

本研究采用双向电泳技术，对市场上购买的鲜乳以及复原乳进行电泳分析，发现电泳图谱与自制参照乳图谱基本一致，可以查找到差异蛋白，是一种行之有效的区分鲜乳和复原乳的检测方法，且该技术重现性好，可为乳品品质研究提供方法补充，从而为下一步乳品市场监管提供有力的技术支撑。