宏基因组二代测序技术辅助诊断新生儿埃可病毒18型聚集性感染

尚永朋，赵宇曦，邓名贵，欧阳莉丽，彭壬海，李佩玉，余治健，邓启文

(1. 深圳大学医学部生物医学工程学院 广东省生物医学信息检测与超声成像重点实验室，广东 深圳 518052；2. 华中科技大学协和深圳医院 深圳大学医学部第六附属医院感染科，广东 深圳 518052)

埃可病毒属于人类肠道病毒B型，主要经粪-口途径传播，多为无症状感染，但由于新生儿的免疫系统尚未发育成熟，其感染埃可病毒发生脑膜炎的风险高，病死率高[1]。近年来，国内儿科及新生儿埃可病毒聚集性感染事件频发，对该病毒快速、准确的检测显得尤为重要[2-11]。埃可病毒病原学检测方法包括：病毒分离、血清抗体检测和逆转录聚合酶链反应(PCR)检测RNA，其中病毒分离检测对设备和人员专业技术要求高，检测周期长，无法作为常规检测方法；血清抗体以及PCR技术虽然检测时间较病毒分离时间明显缩短，但肠道病毒种类和分型较多，治疗方式和预后差异较大，因此两种方法对埃可病毒的诊断意义有限[12]。宏基因组二代测序(metagenomic next-generation sequencing, mNGS)技术可检测细菌、病毒、真菌和寄生虫等多种病原体，为临床上难以培养病原体的诊断提供了有效的技术途径[13-15]。本研究分析在新生儿未知原因感染中，采用mNGS快速辅助诊断肠道埃可病毒18(Echovirus 18, ECO18)型感染的可行性，以及ECO18型传染源和感染情况。

1 材料与方法

1.1 标本来源 采集2020年7月9日—8月6日在深圳某三甲医院新生儿中心新生儿的口咽拭子、粪便拭子和血液标本，医护人员(包括医生、护士、护理员和清洁工) 口咽拭子和肛拭子标本，以及该病房浴缸、厕所、床、奶瓶和脸盆的环境标本。本研究为回顾性研究，凡涉及人的标本检测，均获得该医院伦理委员会审核批准并按照标准执行，新生儿标本获得新生儿监护人知情同意。

1.2 病原学检测 新生儿的血液、口咽拭子和肛拭子标本由检验科常规细菌培养，由华大基因进行mNGS，肠道病毒通用PCR和ECO18型特异性PCR由深圳市南山区疾病预防控制中心完成。肠道病毒通用型引物为5’- CAAGCACTTCTGTTTCCCCGG-3’和5’-ACCCATAGTAGTCGGTTCCGC-3’[16]，ECO18型特异性引物为5’-GGCCCCTGAATGCGGCTAAT-3’和5’-GTTCTGGGATCATTTAA-3’[17]。医护人员的口咽拭子和肛拭子以及环境标本，由华大基因进行mNGS。

1.3 数据可用性声明 生物样本原始数据可以在NCBI生物样本数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/biosample/)中获得，登记号为SAMN14839103-SAMN14839224。

2 结果

2.1 感染病例调查结果 病例1于2020年7月20日因发热、腹泻入该院新生儿中心治疗，7月25日采集其血液、口咽和肛拭子标本，由检验科常规细菌培养并外送金域检验进行肠道病毒检测，同时隔离治疗；检测结果显示：所有标本细菌培养阴性，肠道病毒通用PCR阳性，将其转入隔离病房2，对症治疗后于7月27日治愈出院。7月26—27日病例2、3和6出现轻微腹泻或发热，存在医院感染的风险，逐将病例3转入隔离病房1接受治疗；7月28日病例4和5出现发热、腹泻和皮疹症状。病例2、4、5和6于7月25—27日住在同一病房中，但其床位分布相对分散。见图1～2及表1。为防止疫情暴发，7月28日，新生儿科全面关闭，该病房24例新生儿转移至外院接受隔离治疗并跟踪病情，无发热、腹泻和皮疹症状直至康复出院。出院后，对发热的6例新生儿跟踪随访7 d，采用肠道通用病毒PCR检测新生儿肛拭子标本，结果显示均为阴性。

表1 6例ECO18型感染新生儿的临床资料及检测结果

2.2 病原体鉴定结果 7月29日6例新生儿肛拭子标本肠道通用病毒PCR检测结果均为阳性，除病例1未检测外，其他5例新生儿肛拭子病毒特异性PCR检测结果显示，轮状病毒及埃可病毒11型均阴性。为明确病原体并防止医院感染，将上述6例新生儿的血、口咽拭子和肛拭子标本进行mNGS分析，结果显示6例病例中，病例1、2、3和5肛拭子标本中检出ECO18型病原体，病例2、4和6血标本中检出ECO18型病原体，病例5血标本、口咽拭子和肛拭子中检出人类疱疹病毒6型(HHV-6)病原体。随后对6例新生儿的肛拭子进行ECO18型特异性PCR验证，均为阳性。见表1。不同标本mNGS检出ECO18型病毒情况见表2。

表2 不同标本mNGS检出ECO18型病毒情况

2.3 传播途径调查结果 为追踪埃可病毒感染的来源和传播途径，监测病毒在该病房人群和环境(奶瓶、洗手盆、水力阀、病床等)中的定植或污染情况。7月27日采集该病房中其他18例无发热、腹泻或皮疹症状的新生儿和44名医护人员标本(咽、肛拭子)，以及环境标本，进行肠道病毒通用PCR和mNGS检测，mNGS结果显示18例无症状新生儿肛拭子标本中有2例(N-17和N-33，见图2)ECO18型阳性，其余标本均未检出肠道病毒。

3 讨论

埃可病毒是一种常见的肠病毒亚型，免疫功能不全的新生儿对该病毒高度易感。感染ECO18型的新生儿通常无症状，但也有一些表现为无菌性脑膜炎、急性弛缓性麻痹、发热、腹泻和皮疹[18]。鉴于国内已报告多起由埃可病毒不同型(6、11、18、25型等)引起的医院感染暴发事件，医护人员应警惕埃可病毒在新生儿病房的传播[2-12]。本研究中，新生儿中心6例新生儿感染ECO18型，临床症状轻微，仅表现为发热、腹泻或皮疹等，轻症病例均迅速康复，无后遗症。但多例病例同时发生轻症感染应警惕，尤其应避免引起医院聚集性感染事件的发生。

肠道病毒种类和分型较多，治疗方式和预后差异较大，因此快速鉴定未知病原体的种类和分型是临床急切需要解决的问题[12]。mNGS作为一种辅助临床快速鉴定病原体的工具，可以检测传统方法难以培养或扩增的病原体，近年来多篇报道[15，19-20]表明，利用mNGS方法可以鉴定多种病原体，且能精确分类到种以及分型，其灵敏度和特异度优于传统培养或PCR方法。本研究中所有病例的肛拭子和血标本通过传统的细菌培养，无法检测到病原体，采用肠道病毒通用PCR方法检测为阳性，提示临床病例可能为肠道病毒感染，但采用上述两种方法无法鉴定到具体病原体的种属。本研究特异性PCR结果为常见肠道病毒轮状病毒及埃可病毒11均阴性，特异性PCR难以检测到不常见的肠道病毒种类，有可能误导临床医生排除埃可病毒感染，而采用mNGS方法鉴定出ECO18型。mNGS检测6例新生儿口咽拭子、血和肛拭子标本，3例新生儿血和4例新生儿的肛拭子均检出ECO18型，覆盖了全部6例新生儿，在有明确种类和分型的提示下，对6例病例的肛拭子标本进行ECO18型特异性PCR检测，结果均为阳性，此过程中mNGS对病原体的确定起到了关键的提示作用。另外病例5在血、咽拭子和肛拭子中均检测到HHV-6，提示可能存在合并感染。上述结果表明，在新生儿未知原因发热的感染病毒病原体快速鉴定中，mNGS的早期使用具有重要的临床诊断价值。

因肠道病毒最常见的传播途径是粪-口途径，考虑多例新生儿有共同的管床医生，可能存在医务人员手卫生不规范导致的传播。为追踪病原体的来源和传播途径，采用mNGS和特异性ECO18型PCR方法进一步监测病房中其他新生儿、医护人员口咽拭子和肛拭子标本，以及奶瓶、洗手盆、水力阀、病床等环境标本，结果显示均未检测到ECO18型或其他肠道病毒，提示该病房新生儿的病毒可能并非来自医护人员或环境，也可能是病毒在环境中数量少、存活时间短，难以检出。由于无法确定该病房中病毒的来源和传播途径，为切断感染途径，防止其他新生儿感染，在发现聚集性感染发生的第一时间，执行了以下防控措施：①立即隔离新生儿，专人管理，限制探视；②完善病原学检查，查找感染病因，继续新生儿科治疗方案；③医务人员实施标准预防(接触新生儿及周围环境和物品，须穿戴一次性帽子、口罩、手套、隔离衣)，严格执行无菌操作，规范执行手卫生；④增加病房通风次数，加强环境、设备、新生儿相关物品及空气等消毒工作，增加物体表面、地面消毒频次(含有效氯1 000 mg/L消毒剂擦拭2次/d)；⑤新生儿物品专人专用，奶瓶、奶嘴一人一用一消毒，洗浴盆一人一用一消毒；⑥加强医疗废物管理，所有感染新生儿的生活垃圾及时放入医疗废物袋，按感染性废物处理。

与PCR方法相比，mNGS方法存在成本高的缺点，但其具有快速、灵敏以及准确，且可以同时在物种水平和分型上检出不同病原体的优势[15]。对于本研究的病原体—埃可病毒，mNGS在肛拭子中检出率最高(66.67%)，其次为血(50.00%)，口咽拭子检出率为0，依据任意一种标本阳性则认定为阳性计算检出率，6例病例使用mNGS检出率为100%，提示同时采集不同类型的标本，尤其是肛拭子和血，可以提高肠道病毒检出率。

本研究局限性在于：首先此次新生儿科聚集性感染除病例1为7月20日发热、腹泻外，其余5例均在7月25—28日4 d内出现临床症状，具有时间上的高度重合， mNGS检测结果显示均为ECO18型感染，因此初步判断是同一感染源。但由于本研究中的肛拭子和血标本测序获得的病毒片段数量较少(1～39个reads)，难以拼接成为完整的序列，因此，未进一步进行病毒序列的拼接和比对，无法从序列上验证病原体的同源性。其次，本探究在发现聚集性感染第一时间，对医务人员手和环境标本进行采样和检测，可能由于RNA病毒在环境中容易降解，因此未检测到ECO18型及其他肠道病毒，无法确定本研究中病毒的来源和传播途径。

虽然大多数新生儿感染埃可病毒是无症状感染，但仍有导致脑膜炎，甚至死亡的高风险。因此，在新生儿出现未知原因的发热或腹泻时，快速和准确诊断其感染病原体尤其重要。

综上所述，本研究数据显示，mNGS可以检测出ECO18型感染患者血清或粪便中的低拷贝数ECO18型病毒，证明mNGS是一种有效的辅助性诊断肠道病毒感染的方法，并且具有追溯医院聚集性感染病原体的潜力。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。