半夏-附子药对拮抗冠心病分子机制研究*

杨杰 彭启伦 郭步伐 丁维俊

(1.毕节医学高等专科学校基础医学系，贵州 毕节 551700；2.成都中医药大学基础医学院，四川 成都 610075)

半夏与附子同方配伍一直以来颇受众多医家的争议，源于附子来自乌头的侧根，随后形成了附子反半夏这一假说；同时，《中华人民共和国药典2020版》中指出附子不应与半夏相配伍。然而，半夏附子同方配伍见于众多古方之中，如出自《扁鹊心书神方》的附子半夏汤，以及见于《伤寒杂病伦》的小青龙汤、附子梗米汤和竹叶汤[1-2]。李筠等[3]收集文献1295篇，涉及患者30042例，发现半夏附子同方配伍主要用于治疗咳喘、胸痹、胃炎胃痛等疾病。李玲等[4]研究结果表明，附子与半夏配伍可能通过抗自由基和减少细胞凋亡，对心肌缺血再灌注损伤产生保护作用。

胸痹属于中医病名，与现代医学冠心病有异曲同工之妙，其主要病机为心脾肝肾亏虚，兼有寒凝、气滞、血瘀和痰阻，乃至心脉失养所致。《神龙本草经》中记载附子、半夏为“下品”之药，但却应用广泛。《本章汇言》曰：“附子辛温大热，其性善走，为通十二经纯阳之要药，外则达皮毛而除表寒，里则达下元而温痼冷，彻内彻外，凡三焦经络，诸脏诸腑，果有真寒，无不可治。”半夏味辛性温而燥，为燥湿化痰，温化寒痰之要药。两药性味相似，配伍用药，辛温化痰消瘀而除胸痹，共奏减毒增效之功。

网络药理学已成为系统生物学的一门分支学科，可阐释中药及复方调控疾病靶点、信号通路的整体网络，在中医药等领域应用十分广泛[5-7]。周思思等[8-9]通过UPLC/Q-TOF-MS建立半夏附子配伍后水煎液生物碱成分的化学指纹图谱，并分析其差异变化显著的化学成分。杨欣等[10]应用网络药理学获取8个半夏-附子药对关键活性成分，并筛选了磷脂酰肌醇三激酶α(PI3Kα)，类脂磷酸酶(PTEN)，3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)等抗肿瘤关键靶标蛋白。但是从半夏-附子药对角度切入研究冠心病仍是十分缺乏的。因此，我们通过网络药理学与分子对接方法探究半夏-附子药对拮抗冠心病的分子机制。

1 材料与方法

1.1半夏-附子药对活性成分筛选 在中医药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)收集半夏、附子的化学成分。以口服生物利用度(OB≥30%)和类药性(DL≥0.18)为标准建立半夏-附子药对的化学成分集，并在TCMSP中查询各自化学成分的相应靶点。将上述所收集到的靶点在UniProt数据库中查询基因名，选择的物种为人，以靶基因的缩写表示。

1.2收集疾病相关靶点 以coronary heart disease为关键词在DisGeNET(http://www.disgenet.org/)和OMIM(https://omim.org/)数据库中搜索冠心病相关靶点，然后通过R3.6.2软件将半夏-附子药对活性成分的靶点与冠心病相关靶点绘制韦恩图并取交集，得到共同的靶点。

1.3构建蛋白互作网络(PPI网络) 将上述分析得到的共同靶点导入STRING(https://www.string-db.org/)数据库，选择物种为人，得到了半夏-附子药对治疗冠心病的PPI网络。通过R3.6.2软件将其得到的“TSV”文件进行柱状图分析，计算网络中节点自由度(degree)值，degree值越大表示节点在网络中的核心地位。

1.4GO与KEGG富集分析 使用R3.6.2软件对半夏-附子药对拮抗冠心病的靶点进行GO与KEGG富集分析，选择物种为人，筛选出P<0.05的生物学过程与信号转导通路，并根据富集P值的显著性进行排序，将富集P值前20位的通路以柱状图的形式进行展示。

1.5构建“药物-成分-疾病-靶点-通路”网络并分析 Cytoscape3.7.1是中药及复方网络的可视化分析软件。输入半夏-附子药对活性成分以及半夏-附子药对拮抗冠心病的相关靶点，构建“药物-成分-疾病-靶点”网络。同时，导入KEGG富集信号转导通路，构建“靶点-通路”网络。

1.6分子对接验证 选取PPI网络degree值排名前6位的靶点以及富集8条以上KEGG信号转导通路的靶点与对应活性成分进行分子对接。在PubChem数据库(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载化合物2D结构的“.sdf ”格式文件，并通过Chem3D软件转化为3D结构“.mol2”格式文件。在PDB数据库(http://www.rcsb.org/)中下载靶点的3D结构“.pdb ”格式文件，并经PyMOL软件去除水分子和小分子配体。在AutoDockTools 1.5.6软件中导入靶点的3D结构，经加氢、分配电荷等输出“.pdbqt”格式文件，然后输入活性成分“.mol2”格式文件，并输出活性成分“.pdbqt”格式文件，运行Grid模块设置蛋白原配体对接的活性口袋；最后运行AutoDock_vina 1.1.2分子模拟软件进行分子对接，用结合能评价化合物与受体的匹配情况，采用PyMOL软件绘制最佳匹配结果图。

2 结果

2.1半夏-附子药对活性成分的筛选 从TCMSP数据库中，获取半夏化学成分116个，附子化学成分65个。以OB≥30%，DL≥0.18为条件筛选到半夏化学成分13个，附子化学成分21个。通过TCMCP数据库检索，11个半夏化学成分和6个附子化学成分均查询到相应的靶点。17个化合物的代码、分子名以及相应的口服生物利用度、类药性和相应靶点数值见表1。

2.2半夏-附子药对活性成分拮抗冠心病相关靶点的筛选 在DisGeNET、OMIM中以“coronary heart disease”为关键词搜索冠心病相关靶点1679个，并与半夏-附子药对活性成分相关靶点取交集，得到其共同靶点35个。这些靶点在半夏-附子药对抗冠心病的过程中发挥着一定的作用。

2.3构建并分析半夏-附子药对治疗冠心病相关靶点的PPI网络 将上述35个共同靶点输入STRING数据库，构建半夏-附子药对活性成分拮抗冠心病相关靶点的PPI网络，并通过R语言制作柱状图，展示degree值较高的前30位，见图1。尤其是degree值排名前6位的靶点：AKT1(RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)、FOS(原癌基因)、VEGFA(血管内皮生长因子A)、MMP9(基质金属蛋白酶9)、PPARG(过氧化物酶体增生物激活受体γ)和PTGS2(前列腺素合成酶2)。

表1 半夏-附子药对活性成分表

图1 PPI网络中degree值前30位的靶点

2.4GO生物学过程富集与KEGG通路富集分析 通过R语言对半夏-附子药对活性成分拮抗冠心病的35个相关靶点进行GO生物学过程富集分析，结果显示35个靶点共在57个GO term上富集。图2展示了富集P值较显著的前20位生物学过程，如肾上腺素受体活性(adrenergic receptor activity)、细胞核受体活性(nuclear receptor activity)、转录因子活性(transcription factor activity)、儿茶酚胺结合(catecholamine binding)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)等。

对半夏-附子药对活性成分拮抗冠心病的35个靶点进行KEGG富集分析，结果显示35个靶点共富集在75条信号转导通路上。图3展示了富集P值较显著的前20位KEGG信号转导通路，其中脂质和动脉粥样硬化(hsa05417：Lipid and atherosclerosis)通路富集P值最显著，此通路参与的靶点有9个，在所有信号通路里靶点存在的数量最高，分别为RXRA(视黄酸受体RXR-α)、RELA(转录因子p65)、AKT1(RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶)、BCL2(细胞凋亡调控因子)、FOS(原癌基因)、BAX(细胞凋亡调控因子)、MMP9(基质金属蛋白酶9)、NFATC1(活化T细胞的核因子)和PPARG(过氧化物酶体增生物激活受体γ)。同时，脂质和动脉粥样硬化通路所参与AKT1、FOS、MMP9和PPARG等4个靶点与PPI网络中degree值排名前6位的靶点相吻合，提示了此4个靶点在半夏-附子药对抗冠心病中的重要性。

图2 GO富集分析

2.5构建并分析“半夏-附子药对活性成分-冠心病-靶点-通路”网络 将半夏-附子药对活性成分拮抗冠心病的35个靶点输入Cytoscape 3.7.1软件，构建“半夏-附子药对活性成分-冠心病-靶点”网络(见图4)，此网络图共包含53个节点(一个半夏-附子药对、一种疾病、35个靶基因、16个活性成分)和187条边；将KEGG富集通路导入Cytoscape 3.7.1软件，构建“靶点-通路”网络(见图5)，由富集P值较显著的前20条信号通路与24个靶点组成，其中AKT1富集18条KEGG信号通路，RELA(15)，FOS(12)，MMP9(10)，NFATC1(8)。结合PPI网络degree值排名前6位的靶点进行分析，半夏-附子药对与上述靶点相对应的化合物为baicalein(MOL002714)、coniferin(MOL000519)、Cavidine (MOL002670)、beta-sitosterol(MOL000358)、Stigmasterol (MOL000449)、Deltoin(MOL002392)、Deoxyandrographolide (MOL002395)、Karanjin(MOL002398)、xanthine-9 (MOL006967)等，相应靶点为AKT1、RELA、FOS、MMP9、NFATC1、VEGFA、PPARG、PTGS2等，主要涉及脂质和动脉粥样硬化(hsa05417：Lipid and atherosclerosis)信号转导通路等。

图3 KEGG富集分析

图4 半夏-附子药对活性成分-冠心病-靶点网络

图5 靶点-通路网络

2.6分子对接结果 一般认为，分子对接结合能的绝对值越大，化合物与靶点的结合力越强，构象也就越稳定。某研究表明，结合能绝对值大于5，提示结合能力较高[11-12]；结合能绝对值大于7时，提示结合能力高[6]。表2中所有分子对接结合能绝对值均大于5，尤其是baicalein(AKT1)、baicalein(FOS)、baicalein(MMP9)、baicalein(PTGS2)、cavidine(PTGS2)和deltoin(PTGS2)分子对接结合能绝对值大于9。同时，AKT1、FOS、MMP9和PTGS2靶点与PPI网络degree值排名前6位的靶点相一致。综上分析，baicalein、cavidine和deltoin可能是半夏-附子药对抗冠心病的关键成分。

表2 半夏-附子药对活性成分与冠心病相关靶点的分子对接结果

图6 分子对接模拟图

3 讨论

经数字信息挖掘，半夏与附子中16个活性成分调控35个冠心病相关靶点，涉及75条生物学过程，体现半夏-附子同方配伍抗冠心病的多组分、多靶点和多通路的特点。PPI网络柱状图分析提示了半夏-附子药对活性成分拮抗冠心病的核心靶点，其蛋白产物涉及炎症、脂质代谢、血管内皮调控等重要生理生化过程。因剪切应力和血流量的影响，AKT1为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其在血管内的活性将被来自血液的血管内皮生长因子(VEGF)所激活[13-14]；同时，活化的ATK1将激活血管内皮一氧化氮合成酶(eNOS)，进一步生成一氧化氮(NO)，并促进血管扩张和增强血流量[13-14]。PPARG(过氧化物酶体增生物激活受体γ)的下游信号可产生脂联素，减少脂肪组织炎症，并改善胰岛素抵抗，缓解动脉粥样硬化病变[15-17]。已有研究表明，MMP9(基质金属蛋白酶9)和PTGS2(前列腺素合成酶2)为炎症基因，其血清中水平的升高可增加缺血性中风急性事件的发生，恶化加重冠心病发生的进程[18-25]。总之，以上靶点，炎症基因与抗炎症基因共存，半夏-附子药对活性成分通过协调其平衡而改善冠心病患者的预后，从而很大程度上减少其致死率。

KEGG通路富集分析所得到的信号通路大多数与炎症过程、脂质代谢和动脉粥样硬化相关。由图3可知，脂质和动脉粥样硬化(hsa05417：Lipid and atherosclerosis)[26-28]通路富集P值最显著，可认为是半夏-附子药对活性成分拮抗冠心病的关键信号转导通路。在此通路中，低密度脂蛋白(LDL)通过血管内膜形成轻微氧化修饰的LDL(mmLDL)，再进一步氧化修饰成oxLDL，并被摄取入巨噬细胞，然后吞噬大量脂滴并形成泡沫细胞，进而诱导血管平滑肌细胞增生、迁移，导致动脉粥样硬化斑块的形成。同时、细胞坏死、凋亡将促进不稳定性斑块形成。其中，BCL-2[29-30]、BAX[31-32]和FOS[33-34]是参与细胞凋亡生物学过程的关键基因。经“靶点-通络”网络分析，AKT1、RELA[35-37]、FOS、MMP9和NFATC1[38-41]靶点所参与KEGG信号通络数量较多，而AKT1、FOS和MMP9为PPI网络中degree值排名前6位的靶点，可认为是半夏-附子药对活性成分拮抗冠心病的关键靶点。

经过PPI网络、药物-成分-靶点-通络网络和分子对接分析，半夏-附子药对活性成分所调控的关键冠心病信号转导通路为脂质和动脉粥样硬化通路；根据分子对接结合能绝对值大于9，我们认为半夏-附子药对拮抗冠心病的关键有效成分为baicalein、cavidine和deltoin，其调控的关键靶点为AKT1、FOS、MMP9和PGTS2。但是，后期还需要通过实验进一步进行验证。