抵当芪桂汤对2型糖尿病大鼠肝组织PI3K、Akt基因和蛋白的影响*

韩思荣 屈杰 杨景锋 杨军 谭颖颖 李小会 陈丽名

(陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)是胰岛素分泌不足和(或)胰岛素作用缺陷导致的一种以持续高血糖为主要特征，以多饮、多食、多尿及体重减轻为典型症状的慢性代谢性疾病[1]。由于其发病机制的复杂性，单纯西药治疗对T2DM及其并发症的进程控制不是十分理想。

中医药在防治T2DM及其并发症方面具有多靶点、多途径等不可替代的优势[2]。通过大量的临床观察，导师杨景锋教授指出“气阴两虚，瘀血阻络”是T2DM的关键病机，并以益气养阴、活血通络作为其基本治则治法，将经方抵当汤和黄芪桂枝五物汤化裁组成抵当芪桂汤，用于T2DM及其并发症的临床治疗，疗效显著[3-5]。前期实验研究表明，抵当芪桂汤能够降低血糖水平，保护胰岛细胞，改善胰岛素抵抗[6-8]。本课题在其基础上研究抵当芪桂汤对2型糖尿病大鼠肝组织PI3K、Akt表达的影响，进一步探讨其降糖机制。

1 仪器与材料

1.1主要仪器 悦好Ⅲ型740鱼跃血糖仪及配套血糖试纸(江苏鱼跃医疗设备股份有限公司)；R136切片机(德国Leica)；CX21正置电子光学显微镜(日本OLYMPUS)；Veriti DX梯度PCR仪(Life)；Roche480II荧光定量PCR仪(Roche)；JY88-Ⅱ超声波细胞破碎仪(宁波新芝)；CR22GⅡ台式高速冷冻离心机(日本日立)；ELXSOSIU全波长酶标仪(Thermo)。

1.2实验药物与试剂 抵当芪桂汤(生黄芪30 g，桂枝10 g，酒大黄10 g，炒白芍15 g，水蛭6 g，鬼箭羽20 g组成)，中药材由提供陕西中医药大学校医院提供，品质合格。煎药取液，并浓缩成含生药0.948 g·mL-1和1.896 g·mL-1两种浓度，存储于4 ℃冰箱；盐酸二甲双胍(格华止)，中美上海施贵宝制药有限公司；链脲佐菌素(Streptozotocin)STZ，美国Sigma公司；胰岛素ELISA检测试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；PI3K、Akt抗体，北京博奥森生物技术有限公司。

1.3实验动物 雄性SD大鼠80只，体质量(200±20)g，购买于西安交通大学医学院实验动物中心，动物SPF级许可证号：SCXK(陕)2007- 001。

2 方法

2.1动物模型制备 80只SPF级雄性SD大鼠，适应性喂养1 w后，随机抽取10只作为空白对照组，给予普通饲料。剩下70只作为T2DM造模组，给予高糖高脂饲料，喂养6 w。第7 w，所有大鼠禁食12 h，造模组大鼠按照35 mg·kg-1一次性腹腔注射STZ溶液(将STZ溶于0.1 mol·L-1、pH4.2的枸橼酸缓冲液，配制为1%浓度)，对照组大鼠予按照35 mg·kg-1枸橼酸缓冲液进行腹腔注射。STZ注射72 h后，造模组大鼠尾静脉采血，测FBG≥16.9 mmol·L-1为造模成功。

2.2分组与给药 于STZ注射后的第8 d，将造模成功的60只大鼠按照随机数表分组(见表1)。药物干预6 w后，处死大鼠，留取血清和肝组织。

表1 大鼠分组与给药

2.3指标检测

2.3.1大鼠空腹血糖(FBG)的测定 测定FBG前禁食12 h，于大鼠尾静脉采血，用鱼跃血糖仪及配套血糖试纸检测。

2.3.2大鼠糖化血红蛋白(HbA1c)的测定 由陕西中医药大学第二附属医院检验中心采用全自动生化分析仪测定HbA1c含量。

2.3.3大鼠肝组织胰岛素的测定 按照大鼠胰岛素酶联免疫分析(ELISA)试剂盒说明书，应用双抗体夹心法测定标本中肝组织胰岛素水平。

2.3.4RT-PCR法检测大鼠肝组织PI3K、AktmRNA的表达 匀浆器处理肝组织后，进行肝组织总RNA的抽提，采用RT-PCR法检测肝组织PI3K、AktmRNA的表达。见表2。

表2 引物序列表

2.3.5WB法检测大鼠肝组织PI3K、Akt蛋白的表达 匀浆器处理肝组织后，提取肝组织总蛋白，采用Western-blot法检测肝组织PI3K、Akt蛋白的表达。

3 结果

3.1对大鼠空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)和肝组织胰岛素水平的影响 与Control组相比，Model组大鼠的FBG、HbA1c和肝组织胰岛素水平均升高(P<0.01)；与Model组相比，Met组、DQZ组、DQZX组的FBG、HbA1c和肝组织胰岛素水平均呈现不同程度降低(P<0.05或P<0.01)；与Met组相比，DQZ组的FBG、HbA1c和肝组织胰岛素水平差异无统计学意义(P>0.05)。DQZX组与药物干预各组相比，其HbA1c和肝组织胰岛素降低最为显著(P<0.05或P<0.01)。见表3和图1。

表3 各组大鼠FBG、HbA1c、肝组织胰岛素水平

图1 各组大鼠FBG、HbA1c、肝组织胰岛素水平柱形图

3.2对大鼠肝组织PI3K、AktmRNA表达的影响 RT-PCR结果见图2。与Control组比较，Model组大鼠肝脏组织的PI3K、AktmRNA的表达均降低(P<0.01)；与Model组比较，药物干预各组大鼠的肝脏组织PI3K、AktmRNA的表达均有所上调(P<0.01)；与Met组相比，DQZ组的PI3K、AktmRNA的表达组间差异无统计学意义(P>0.05)；DQZX组与药物干预各组相比，其PI3K、AktmRNA的表达上调最为显著(P<0.05或P<0.01)。见图2。

图2 各组大鼠肝组织PI3K、AktmRNA表达柱状图

3.3对大鼠肝组织PI3K、Akt蛋白表达的影响 经过图像分析可知：与Control组比较，Model组大鼠肝脏组织中的PI3K、Akt蛋白的表达水平均降低(P<0.01)；与Model组比较，药物干预各组的PI3K、Akt的蛋白表达均升高(P<0.01)；与Met组相比，DQZ组的PI3K、Akt的蛋白表达组间存在差异(P<0.05或P<0.01)；DQZX组与药物干预各组相比，其PI3K、Akt蛋白的表达上调最为显著(P<0.01)。见图3、4。

图3 各组大鼠肝组织PI3K、Akt蛋白表达条带图 图4 各组大鼠肝组织PI3K、Akt蛋白表达柱状图

4 讨论

研究发现T2DM发生的主要病理机制是胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)，而IR是由于长期摄入过量的高糖高脂饮食，导致机体糖脂代谢紊乱而诱发是指人体内发挥降糖效力的胰岛素靶器官(肝脏、肌肉和脂肪)对胰岛素的反应力降低，导致其促使葡萄糖代谢的能力下降，肝糖原合成障碍，表现为血糖升高[9-10]。故本实验通过给予大鼠高糖高脂饲料喂养6周，诱导其发生胰岛素抵抗，并按照35 mg·kg-1一次性腹腔注射STZ溶液破坏部分胰岛细胞，造成胰岛β细胞损伤，使血糖升高，T2DM大鼠的造模成功率高达85%。这两者结合所诱导的病理改变更加接近于人类的T2DM[11]。

基于多年临床实践经验，杨景锋教授认为T2DM患者中气虚血瘀情况较为多见，表示该病主要病因病机为“气阴两虚，瘀血阻络”，故以益气养阴、活血通络作为其基本治则治法，将经方抵当汤与黄芪桂枝五物汤加减组成抵当芪桂汤，用于T2DM及其并发症的治疗，临床疗效显著。该方以黄芪、炒白芍为君药，益气养阴生津；桂枝温通经络，水蛭、酒大黄活血化瘀，共为臣药；并以鬼箭羽为佐，破血祛瘀。诸药合用，补益而不郁滞，祛瘀而不伤正，共奏益气养阴、活血通络之效。本次实验结果表明抵当芪桂汤可以降低血糖和肝组织胰岛素水平，同时当二甲双胍联合抵当芪桂汤治疗T2DM大鼠时，可增加其降糖疗效。提示抵当芪桂汤可能通过提高肝脏组织对胰岛素的敏感性，增加其对葡萄糖的摄取和利用，以降低血糖水平。

胰岛素需要与靶组织的胰岛素受体结合，与下游的信号蛋白发生作用，引发一系列的级联反应，继而调控葡萄糖的代谢。其中，PI3K/Akt通路是肝脏胰岛素信号转导的主要途径，负责调节葡萄糖代谢、β细胞存活、胰岛素基因转录等过程[12-14]，在血糖代谢方面占据重要地位，该通路信号传导异常会导致T2DM肝脏IR[15-17]。当胰岛素进入血液后，与肝细胞膜上的特异性受体相结合，并激活胰岛素受体底物-1(IRS-1)。随之与下游PI3K的P85调节亚基结合，激活PI3K P110亚基，使Akt磷酸化。Akt活化后通过抑制糖原合成酶激酶的活性，使糖原合成酶活性增强，促进肝糖原合成[18-20]；同时Akt活化后会与葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)结合，促进葡萄糖的跨膜转运，共同维持体内血糖的稳态[21]。本实验结果显示，Model组大鼠肝组织中PI3K、Akt基因和蛋白的水平明显降低，抵当芪桂汤高剂量组、抵当芪桂汤常量组、抵当芪桂汤加二甲双胍组的PI3K、Akt基因和蛋白表达均有不同程度的上调。提示抵当芪桂汤可能通过调控PI3K/Akt信号通路关键因子的表达，改善肝脏胰岛素抵抗状态，从而降低血糖，达到防治T2DM的目的。