基于网络药理学研究马钱子抗肿瘤的作用机制*

郭玉岩，李春成，孙爽，杨大宇，吕邵娃

黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040

马钱子（Strychnosnux-vomica L.）为云南马钱或马钱的成熟种子［1］，是临床常用的一味中药，苦寒，有大毒，归肝、脾经，具有通络止痛、散结消肿的功效［2］，由于其药理活性较为明显，为历代医家所推崇。现代研究表明马钱子可有效拮抗肿瘤的发展进程，多项报道显示马钱子中的马钱子碱具有增强细胞免疫功能、抑制肿瘤血管生成、减少肿瘤细胞增殖、促进细胞凋亡的作用［3-5］；同时，还可以通过调控癌细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等表达［6］，影响癌细胞与内皮细胞黏附能力，抑制癌细胞转移［7］。目前对于马钱子的抗肿瘤机制研究主要集中在活性成分对肿瘤细胞的生长抑制和促凋亡方面［8-12］，且马钱子抗肿瘤的作用成分也只限于马钱子碱［13］，其作用的靶点和通路又是如何，值得深入探讨。马钱子含有近百种化合物，并作用于多种细胞靶标，很难用常规方法系统地研究马钱子的协同作用机制，网络药理学为复杂的分子机制及中药药效物质基础研究提供了新的方法［14］，通过分析各种复杂和多层次的交互网络更好地阐述了成分和多目标药物的协同作用及其潜在机制。已被广泛应用于研究中药、中药药对，中药复方作用于疾病的分子机制研究［15］。为此，本文通过网络药理学方法研究活性成分抗肿瘤的作用靶点，对成分-靶点-疾病进行系统可视化网络图的构建，对靶基因进行GO功能富集分析、KEGG信号通路分析，进而阐明马钱子抗肿瘤的潜在分子机制。

1 资料与方法

1.1 筛选马钱子的活性成分以马钱子为关键词，从中药系统药理学分析平台中获取所有化学成分。将口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-like，DL）≥0.18作为筛选条件，从而得到活性成分。其中OB和DL是筛选活性成分的重要指标［16］。

1.2 作用靶点的获取以马钱子为研究对象，采用Pharm Mapper Server数据库以人类蛋白靶标为研究对象进行反向分子对接和网络药理学研究，反向分子对接方法主要通过Pharm Mapper服务器来实现，采用药效团匹配方法，以活性小分子为探针，通过对Targetbank、Drugbank数据库预测活性成分潜在靶点。利用R软件对UniProt数据库的作用靶点进行转化，获得其相应靶点的人源靶点基因名称（Gene name）。从Gennecards（https：／／www.genecards.org／）数据库，以“cancer”为关键词，检索与肿瘤相关的靶点基因，导出证据来源可靠的靶点基因（Relevance score＞20）。利用R软件对活性成分的作用靶点及肿瘤疾病靶点基因取交集，得到疾病-药物的共同作用靶点（Gene name），利用Metascape（http：／／metascape.org／）数据库，导入相应基因，得到Gene ID。

1.3 成分-靶点-疾病网络图的构建将马钱子活性成分所对应的靶点基因和肿瘤相关的靶标基因进行匹配，获得两者的共同基因即马钱子抗癌的关键靶点。使用Cytoscape软件（Version 3.6.1）构建成分-靶点-疾病网络图。网络中的节点（node）代表成分、靶点与疾病；网络中的边（edge）用来连接药物与活性成分、活性成分与靶点基因。整个网络展示马钱子药物-活性成分-靶点之间的联系。

1.4 PPI网络图的构建将所得的交集靶点基因输入STRING在线分析平台，物种类别选择Homo sapiens，获得靶点相互作用PPI网络图。将结果以TSV格式导出，利用R软件筛选关键的靶基因。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析利用R软件并使用STRING和Bioconductor数据库，导入相应基因，P值选择0.05作为筛选条件，得到GO、KEGG通路富集分析结果，并分别绘制柱形图和气泡图。

2 结果

2.1 主要活性成分的筛选本研究基于数据的复杂性、样本量的考虑，选择DL≥0.18，OB≥30%作为筛选条件。通过中药系统药理学分析平台共检索出62个化学成分，剔除未找到作用靶点的成分，最终共得到活性化合物14个。对活性成分数据分析发现，（+）-儿茶素、（S）-金罂粟碱、马钱子碱氮氧化物在这些活性成分中具有较高的OB值，而马钱子碱、士的宁，虽然OB、DL值较低，但文献报道这些化合物含量较高，是具有药效的活性成分，故一并纳入，最终确定候选马钱子活性化合物14个，见表1。

表1 马钱子活性成分的筛选

2.2 网络图的构建及共有靶点的筛选通过反向分子对接预测马钱子的活性成分作用靶点有25个，在Genecards数据库检索肿瘤共有11 606相关的靶点，筛选相关性分数（Relevance score）＞20得到487个肿瘤疾病靶点。利用R软件筛选共有靶点，共有7个马钱子作用靶点分别为ESR1、PGR、AR、ESR2、NCOA1、PLAU，CASP3。见表2。

表2 马钱子抗肿瘤疾病相关靶点

2.3 药物成分-靶点-疾病网络图的构建以TCMSP和Genecards为平台，将药物成分与共有靶点之间的关系、共有靶点与疾病之间的关系做成Excel表格，输入Cytoscape 3.6.1生成相关网络图，因共有靶点与药物之间共有4个成分与共有靶点关系紧密，故删除多余药物成分，建立药物成分-靶点-疾病关系网络图。该网络图中黄色节点代表化学成分，紫色节点代表肿瘤药物靶点，从图中可以看出，马钱子通过多成分、多靶点起到抗肿瘤的作用。见图1。

图1 马钱子药物成分-靶点-疾病网络图

2.4 构建靶点基因PPI网络图通过STRING在线分析平台，得到靶点相互作用PPI网络图共有7个节点14条边，平均节点度值为4，采用R软件计算靶点相互作用出现的频数，依次为ESR1、PGR、AR、CASP3、NCOA1、ESR2，PLAU，这些靶点是在马钱子抗肿瘤相关靶点PPI网络中最关键的7个基因，进而阐释了马钱子作用于这7个靶点，靶点之间相互联系、相互作用、相互协同，起到抑制肿瘤细胞生长和转移的作用。见图2。

图2 共有靶点相互作用PPI网络

2.5 GO及KEGG富集分析通过R软件对马钱子抗肿瘤作用靶点进行GO富集分析，筛选P＜0.05的生物过程共有105个，并对前20个重要的功能分析进行数据可视化处理，结果见图3、图4。由此得出GO生物过程富集分析的马钱子抗肿瘤转移靶点所涉及的生物过程包括核受体活性、转录因子活性特异性DNA结合、类固醇激素受体活性、类固醇结合、RNA聚合酶II基础转录因子结合、基础转录机制结合、基底RNA聚合酶II转录机制结合、ATP酶结合、β-连环蛋白结合、RNA聚合酶II转录因子结合等。提示马钱子的活性成分可能通过干预以上生物学过程而抑制肿瘤的生成和转移。

图3 马钱子活性成分抗肿瘤关键靶基因GO富集分析

通过对马钱子抗肿瘤转移靶点进行KEGG信号通路富集分析，筛选出P＜0.05的信号通路117条，利用R软件分析后将重要的20条通路可视化，结果见图5。马钱子的抗肿瘤转移靶点主要涉及催乳素信号通路、前列腺癌、内分泌抵抗、雌激素信号通路、癌症的蛋白多糖等，协同参与调控肿瘤生成和转移过程而起到抗肿瘤作用。

图5 马钱子抗肿瘤KEGG通路富集分析

3 讨论

本文通过网络药理学方法预测得到马钱子中马钱子碱（Brucine）、刺罂粟碱［（S）-Stylopine］、Icaride A、儿茶素［（+）-Catechin］4种抗肿瘤活性成分。据报道，马钱子碱具有显著的抗肿瘤作用，可抑制人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的细胞迁移、细胞侵袭和血管生成拟态形成［17］，能够有效抑制肝癌细胞黏附，阻止肝癌细胞运动和侵袭［18］，还可明显抑制人白血病K562细胞株及HL-60细胞，并诱导细胞凋亡［19］。而除马钱子碱外，其中刺罂粟碱、Icaride A、儿茶素等3种潜在药效成分也可起到协同抗肿瘤作用，值得进一步实验研究。通过反向分子对接和网络药理学研究筛选得到ESR1、PGR、AR、ESR2、NCOA1、PLAU、CASP3等7个最关键的靶点。通过构建马钱子药物-成分-疾病靶点网络、靶基因PPI网络，发现靶点间通过相互作用，共同协调增殖、凋亡、分化和代谢过程进而抑制肿瘤的转移。其中ESR1［20］、CASP3［21］是马钱子抗肿瘤重要的靶点。雌激素受体ESR1在正常的乳腺发育中起着至关重要的作用，ESR1扩增与肿瘤大小、阳性淋巴结数目、阴性ERalpha和阳性人表皮生长因子受体状态呈负相关，且与ER蛋白的较高表达水平密切相关，其对肿瘤进展及内分泌治疗耐药的产生发挥重要作用。CASP3是马钱子抗肿瘤的重要作用靶点，是肿瘤细胞凋亡反应的关键调节因子［22］，在肿瘤发生过程中显示与半胱氨酸蛋白酶钙蛋白酶家族的相互作用，其表达影响肿瘤患者的特异性生存率，并在不同的表型中提供了更多的预后价值［23］。

进一步对马钱子抗肿瘤相关的作用靶点进行GO生物过程富集分析、KEGG信号通路分析，得到6条信号通路与抗肿瘤有关，包括催乳素信号通路、前列腺癌、内分泌抵抗、雌激素信号通路、癌症中的蛋白多糖等。研究表明，其中具有代表性的内分泌抵抗［24］、雌激素信号通路［25］、催乳素信号通路［26］在肿瘤发生和发展所有阶段的细胞内信号转导途径发挥重要作用，不仅可以通过自身的信号转导过程介导细胞活性，还可共同介导细胞中复杂的生物活动；马钱子抗肿瘤转移靶点所涉及的生物过程包括核受体活性、转录因子活性特异性DNA结合、类固醇激素受体活性、类固醇结合等。通过对马钱子抗肿瘤相关的作用靶点进行GO生物过程富集分析、KEGG信号通路分析，证明了马钱子是通过多靶点、多通路发挥抗肿瘤作用。

本文通过筛选马钱子活性成分并预测抗肿瘤作用靶点，构建成分-疾病-靶点网络图，构建PPI网络，对靶点进行GO、KEGG分析等网络药理学的方法深入研究马钱子的抗肿瘤转移作用的分子机制，成功预测了马钱子抗肿瘤的主要活性成分、抗肿瘤作用靶点及与其相关的信号通路和生物过程，体现了中药多成分多靶点作用于疾病的复杂机制，对于马钱子抗肿瘤提供了研究基础。