青藤碱通过ERK1／2-GSK3β-NFκB信号通路对肾移植大鼠急性排斥反应的作用及机制研究*

王晓勃，王长安，吴秋杰

郑州市第七人民医院，河南 郑州 450000

终末期肾病是各种肾脏疾病发展到肾衰竭阶段的共同综合征，肾移植是目前治疗终末期肾病最有效的方法，对于提高患者的生命质量具有重要意义［1］。随着临床移植水平的提高及各种新型免疫制剂的应用，肾移植效果得到显著改善，患者短期内的生活质量明显提高，但长期存活率依然较低［2-3］。肾移植术后的急性排斥反应仍是术后最主要的难题，也是导致慢性排斥反应和移植肾失功的首要原因，同时长期使用免疫抑制剂给患者带来较大不良反应，影响患者长期生活质量［4］。因此，寻找一种安全有效的抑制急性排斥反应的药物，是保证移植肾长期存活的关键。青藤碱（sinomenine，SIN）是从中药青风藤中提取的一种生物碱单体，具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等药理学作用，对多种疾病均有较好疗效［5-6］。既往研究显示，SIN具有阻滞免疫应答减少排斥反应的作用［7］，但其具体作用机制研究尚少。本研究通过建立同种异体肾移植大鼠模型，探讨SIN在肾移植急性排斥反应中的作用，为SIN用于临床治疗肾移植急性排斥反应提供理论基础。

1 材料

1.1 动物供体：Wistar大鼠，雄性，80只，7～8周龄，体质量（270±20）g，受体：SD大鼠，雄性，90只，7～8周龄，体质量（250±20）g，所有大鼠均为SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK（京）2016-0001。大鼠购入后保持温度（23±2）℃，湿度（50±5）%，明暗周期12 h／12 h循环，适应性饲养7 d。本研究经郑州市第七人民医院伦理委员会审核通过，伦理批号：20191015031。

1.2 药物与试剂青藤碱（≥98%，每支20 mg，成都曼斯特生物科技有限公司，批号：191016）；环孢素A（cyclosporin A，CsA）注射剂（≥99%，每支250 mg，挪威Sandoz公司，货号：B28163）；戊巴比妥钠（青岛捷世康生物科技有限公司，批号：191203）；肝素钠（武汉德晟生化科技有限公司，批号：190901）；平衡盐溶液（北京百奥莱博科技有限公司，货号：GL1724）；注射用青霉素钠（山东鲁抗医药股份有限公司，批号：191108）；甲醛溶液（美国Merck公司，货号：47608）；白细胞介素（interleukin，IL）-2、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫分析检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，批号：191015、190906）；Trizol试剂盒（美国Invitrogen公司，货号：15596-018）；反转录试剂盒（日本TaKaRa公司，货号：RR036A），兔抗大鼠细胞外信号调节激酶1／2（extranal-signal regulated kinase 1／2，ERK1／2）、p-ERK1／2、糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）、p-GSK3β、核转录因子κB（nuclear transcription factor κB，NF-κB）p65、p-NF-κB p65一抗（美国Abcam公司，货号：ab17942、ab126445、ab185141、ab68476、ab239882、ab239882）。

1.3 仪器AU5800型全自动生化分析仪（Beckman Coulter）；M10125型PCR仪、Experion型电泳仪（美国Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 大鼠肾移植急性排斥模型的建立及分组取80只Wistar供体大鼠，术前12 h禁食不禁水，按1 mL·kg-1腹腔注射体积分数3%戊巴比妥钠进行麻醉，仰卧固定后，由剑突至耻骨联合，腹部正中切口，暴露腹腔，钝性分离输尿管及膀胱，游离腹主动脉及下腔静脉，结扎周围血管，游离左肾及肾动静脉，结扎肾上腺动静脉。用血管夹夹闭腹主动脉，将4℃肝素平衡盐溶液（含肝素钠625 U·mL-1）灌注左肾，结扎左肾静脉，待供体肾颜色变为黄白色，肾静脉流出液体变清亮时停止灌注，切断左肾相关联的输尿管、腹主动脉和下腔静脉取下，剪去供肾多余的脂肪组织及下腔静脉，适当修整后放入4℃肝素平衡盐溶液中保存。取80只SD受体大鼠麻醉后暴露左肾并切除，将供肾置入受体腹腔，静脉端行端端吻合，动脉端行端侧吻合，打开血管夹，供肾充血变红，输尿管周围可见明显渗血，连续缝合腹壁肌层。术后肌肉注射青霉素10万单位，连续3 d，预防感染，其余10只SD大鼠设为假手术组，开腹后游离左肾，不做切除，之后关腹，其他操作同上。将手术成功68只大鼠随机分为模型组17只，SIN低剂量组17只，SIN高剂量组17只，阳性对照组17只。

2.2 干预方法术后24 h，盐酸青藤碱用生理盐水稀释成质量分数1%的溶液，CsA用生理盐水稀释成0.25%的溶液，SIN低剂量组、SIN高剂量组分别按15 mg·kg-1、30 mg·kg-1体质量腹腔注射盐酸青藤碱溶液，阳性对照组按5 mg·kg-1体质量腹腔注射CsA，每天1次，假手术组和肾移植组大鼠腹腔注射等量生理盐水，至受体鼠死亡。

2.3 观察生存时间术后大鼠正常饲喂，模型组、SIN低剂量组、SIN高剂量组、阳性对照组随机各取8只大鼠，用于观察大鼠存活时间。

2.4 检测肾功能移植7 d后，模型组、SIN低剂量组、SIN高剂量组、阳性对照组剩余大鼠及假手术组大鼠，麻醉后，腹主动脉采血5mL，2 500 r·min-1（离心半径10 cm）离心20 min，取上清，一部分使用全自动生化分析仪检测血清肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平；另一部分于-20℃保存。

2.5 检测血清IL-2、TNF-α水平取保存血清，采用酶联免疫分析法检测血清IL-2、TNF-α水平，操作步骤严格按照ELISA试剂盒说明书，反应结束后，用酶标仪在波长450 nm处读取吸光值，根据标准品浓度和吸光值绘制标准曲线，计算各组大鼠血清IL-2、TNF-α水平。

2.6 观察肾组织病理学变化采血完毕，处死大鼠，摘取左肾，沿冠状面切开后，一半置于40 ng·L-1中性甲醛中固定24 h，取出固定好的肾脏标本，依次进行浓度梯度酒精脱水，通过二甲苯透明，放入液体石蜡进行包埋，冷却后切片（片厚约4μm），行常规HE染色，中性树胶封片后，于显微镜下观察肾形态学变化。按照Banff肾移植病理分类［8］，分别对小动脉内膜增生、肾小管萎缩、间质纤维化、肾小球硬化、单个核细胞浸润等损害进行评分，每项得分0～3分，采用双盲法由2名人员单独对每只大鼠进行评分，取两人评分的均值作为最终评分。

2.7 检测大鼠肾脏ERK1／2 mRNA、GSK3βm RNA、NF-κB p65 mRNA水平左肾另一半置于液氮中保存。取液氮保存肾组织70 mg，使用Trizol试剂盒说明书提取总RNA，测定其纯度和浓度，取总RNA按照反转录试剂盒说明书反转录成cDNA，引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列见表1。反应体系包括：模板cDNA 2μL，上下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶10μL，双蒸水6μL。以β-actin为内参，进行PCR扩增。扩增条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，35个循环。采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达水平。

表1 引物序列

2.8 检测大鼠肾脏ERK1／2、GSK3β、NF-κB p65及其磷酸化蛋白水平取液氮保存的肾脏80 mg，冰上研磨，离心取上清，加入RIPA裂解液裂解细胞，BCA法检测蛋白浓度，100℃水浴5 min蛋白变性，蛋白上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，半干法将蛋白转移至PDVF膜，5%脱脂牛奶摇床封闭1 h，TBST溶液洗膜，加入稀释的一抗ERK1／2、p-ERK1／2、GSK3β、p-GSK3β、NF-κB p65、p-NFκB p65（1∶2 000）、β-actin（1∶4 000）4℃摇床过夜，TBST溶液洗膜，加入HRP标记的稀释后的二抗（1∶5 000），室温摇床孵育1 h，TBST溶液洗膜，滴加ECL试剂，暗室下显影、曝光成像。通过Image J软件分析图像，以目的蛋白与内参蛋白条带灰度比值表示目的蛋白的相对表达水平。

2.9 统计学方法采用SPSS 24.0统计软件分析数据，计量资料以平均值±标准差（±s）表示，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，两两样本比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠存活时间比较与模型组比较，SIN低、高剂量组和阳性对照组大鼠平均存活时间极显著延长（P＜0.01）；与SIN低剂量组比较，SIN高剂量组和阳性对照组大鼠平均存活时间极显著延长（P＜0.01）。见表2。

表2 大鼠存活时间比较 （±s，d）

注：与模型组比较，**P＜0.01；与SIN低剂量组比较，＃＃P＜0.01，＃＃＃P＜0.001

存活时间模型组组别 n 7.96±0.83 SIN低剂量组 9 9.72±0.98**SIN高剂量组 9 11.75±1.16**＃＃阳性对照组 9 12.14±1.25**＃＃＃9

3.2 各组大鼠血清Scr、BUN水平比较与假手术组比较，模型组血清Scr、BUN水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，SIN低、高剂量组和阳性对照组血清Scr、BUN水平降低（P＜0.05）；与SIN低剂量组比较，SIN高剂量组和阳性对照组大鼠血清Scr、BUN水平极显著降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清Scr、BUN水平比较（±s）

表3 各组大鼠血清Scr、BUN水平比较（±s）

注：与假手术组比较，***P＜0.001；与模型组比较，＃＃＃P＜0.001；与SIN低剂量组比较，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

组别 n Scr（c／μmol·L-1）BUN（c／mmol·L-1）10 68.26±10.54 9.16±3.01模型组 9 163.58±16.21*** 53.25±5.29***SIN低剂量组 9 122.98±15.13＃＃＃ 36.13±3.32＃＃＃SIN高剂量组 9 97.56±12.22＃＃＃△△ 22.49±2.56＃＃＃△△△阳性对照组 9 93.21±13.14＃＃＃△△△20.18±2.61＃＃＃假手术组△△△

3.3 各组大鼠血清IL-2、TNF-α水平比较与假手术组比较，模型组大鼠血清IL-2、TNF-α水平极显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，SIN低、高剂量组和阳性对照组大鼠血清IL-2、TNF-α水平极显著降低（P＜0.001）；与SIN低剂量组比较，SIN高剂量组和阳性对照组血清IL-2、TNF-α水平极显著降低（P＜0.01）。见表4。

表4 各组大鼠血清IL-2、TNF-α水平比较 （±s）

表4 各组大鼠血清IL-2、TNF-α水平比较 （±s）

注：与假手术组比较，***P＜0.001；与模型组比较，＃＃＃P＜0.001；与SIN低剂量组比较，△△△P＜0.001

组别 n IL-2（ρ／ng·L-1）TNF-α（ρ／μg·L-1）10 90.26±28.15 43.63±8.59模型组 9 556.12±50.26*** 136.58±13.48***SIN低剂量组 9 384.67±42.73＃＃＃ 96.21±10.63＃＃＃SIN高剂量组 9 221.19±31.48＃＃＃△△△72.64±9.14＃＃＃△△△阳性对照组 9 207.25±30.23＃＃＃△△△69.58±8.98＃＃＃假手术组△△△

3.4 大鼠肾脏形态学变化假手术组大鼠肾脏肾小管及肾间质结构正常，未见明显损伤；模型组大鼠肾小管上皮细胞肿胀，部分细胞出现坏死、萎缩，肾间质充血，出现管型和间质内炎细胞浸润；SIN低剂量组、SIN高剂量组和阳性对照组均有不同程度改善，肾间质充血缓解，炎性细胞浸润减少。见图1。

与模型组比较，SIN低、高剂量组和阳性对照组Banff评分极显著降低（P＜0.001）；与SIN低剂量组比较，SIN高剂量组和阳性对照组Banff评分降低（P＜0.05）。见图1。

图1 各组大鼠肾脏病理学改变（HE染色，×200）

表5 肾组织Banff评分比较 （±s，分）

表5 肾组织Banff评分比较 （±s，分）

注：与模型组比较，***P＜0.001；与SIN低剂量组比较，＃＃＃P＜0.001

评分模型组组别 n Banff 11.26±1.21 SIN低剂量组 9 7.39±1.06***SIN高剂量组 9 3.25±0.91＃＃＃阳性对照组 9 3.07±0.83 9＃＃＃

3.5 各组大鼠肾脏ERK 1／2、GSK 3β、NF-κB p65蛋白及其磷酸化蛋白水平比较与假手术组比较，模型组大鼠肾脏p-ERK1／2、p-GSK3β、p-NFκB p65蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与模型组比较，SIN低剂量组、SIN高剂量组、阳性对照组大鼠肾脏p-ERK1／2、p-GSK3β、p-NF-κB p65蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；与SIN低剂量组比较，SIN高剂量组、阳性对照组p-ERK1／2、p-GSK3β、p-NF-κB p65蛋白相对表达量降低（P＜0.05）。见表6，图2。

表6 各组大鼠肾脏p-ERK 1／2／ERK 1／2、p-GSK3β／GSK3β和p-NF-κB p65／NF-κB p65比较 （±s）

表6 各组大鼠肾脏p-ERK 1／2／ERK 1／2、p-GSK3β／GSK3β和p-NF-κB p65／NF-κB p65比较 （±s）

注：与假手术组比较，***P＜0.001；与模型组比较，＃＃＃P＜0.001；与SIN低剂量组比较，△△P＜0.01，△△△P＜0.001

B p65假手术组组别 n p-ERK1／2／ERK1／2 p-GSK3β／GSK3β p-NF-κB p65／NF-κ 10 0.34±0.06 0.42±0.06 0.32±0.05模型组 9 0.99±0.08*** 0.96±0.09*** 0.97±0.09***SIN低剂量组 9 0.77±0.07＃＃＃ 0.77±0.08＃＃＃ 0.78±0.08＃＃＃SIN高剂量组 9 0.60±0.07＃＃＃△△△ 0.62±0.07＃＃＃△△ 0.53±0.06＃＃＃△△△阳性对照组 9 0.55±0.06＃＃＃△△△ 0.61±0.07＃＃＃△△△ 0.50±0.07＃＃＃△△△

图2 肾组织各蛋白表达水平

4 讨论

肾移植是目前最成熟的器官移植手术之一，受者术后需使用免疫抑制剂（如CsA等）以控制肾术后急性排斥反应［9-10］。但免疫抑制剂存在肝、肾毒性及骨髓移植等不良反应，导致机体免疫力下降、感染增加，降低移植肾存活时间，减少免疫抑制剂对患者的困扰，延长移植肾存活时间，成为肾移植方向急需解决的问题［11］。研究显示，多种中药及其活性成分在抑制免疫方面具有显著效果，为解决同种异体肾移植排斥反应提供新的方法和途径［12-13］。青风藤在我国民间用于风湿痹痛历史悠久，SIN是青风藤主要活性成分，临床上用于类风湿类关节炎等多种自身免疫性疾病的治疗，疗效确切、安全性高，在器官移植术后的抗免疫排斥也凸显出良好效果，逐渐用于多方面免疫耐受的研究［14］。

当肾功能受损时，会导致Scr、BUN无法排出，浓度升高。IL-2可促进排斥反应发生，逆转已经产生的免疫耐受，TNF-α能促进炎症因的产生，发生放大效应，加重炎症细胞的聚集和浸润。SIN是从中药中提取的生物活性碱，在创伤性脊髓损伤、脓毒症等疾病中具有明显抗炎效果［15-16］。研究显示，SIN可通过降低移植物中的炎症因子，对移植器官产生抗免疫排斥作用［17］。本研究发现，SIN各组较模型组大鼠生存时间延长，大鼠血清Scr、BUN、IL-2、TNF-α水平降低，Banff评分降低，病理损伤得到改善，且SIN高剂量组与CsA的阳性对照组效果相当，提示SIN可降低肾移植大鼠炎性反应、抗肾移植急性排斥反应，发挥肾保护作用。研究报道，SIN可延长皮肤移植小鼠模型中移植皮片的存活时间，降低血浆IL-2水平，具有抑制免疫排斥反应的作用［18］。研究显示，SIN可降低肝细胞癌大鼠模型肝移植术后炎症因子水平，抑制细胞免疫反应［19］。邓卫平等［20］在巨细胞病毒性肝炎模型大鼠中得到类似结果，SIN相关制剂可阻断抗原递呈作用，减轻肝移植术后急性排斥反应。以上研究均提示，SIN在器官移植方面的抗排斥反应作用，本研究结果也显示SIN对同种异体肾移植大鼠具有一定抑制急性排斥反应作用，发挥肾保护作用。

ERK1／2是一种丝氨酸／苏氨酸类激酶，磷酸化活化后通过促使细胞内外信号转移，调控细胞的增殖、凋亡、分化等［21］。GSK3β与多条信号通路关系密切，表达失调可引起肿瘤、神经性疾病、糖尿病等多种疾病［22-24］。NF-κB在体内广泛参与炎症调节过程，通常以p50-p65异二聚体的形式存在呈非活化状态，活化后产生多种细胞因子参与炎症反应［25］。器官移植后，活化的ERK1／2通过磷酸化下游GSK3β，进而激活NF-κB，诱导下游炎症细胞因子释放，促进炎症细胞浸润，加重排斥反应［26］。研究证实，p-GSK3β和p-NF-κB p65表达异常升高，与器官移植后移植物失功有密切关系［27］。ERK1／2表达降低后，可显著抑制p-GSK3β表达，进而调控ERK1／2-GSK3β-NF-κB信号通路，减轻炎症反应［28］。研究显示，ERK1／2活化被抑制后，通过下游级联反应，降低NF-κB表达，减轻细胞炎症反应［29］。研究表明，激活ERK1／2-GSK3β-NF-κB信号通路可引起大鼠肾移植术后炎症反应，促进慢性肾失功进展，而抑制该通路后，可延缓肾失功进展［30］。本研究SIN各组大鼠肾脏p-ERK1／2、p-GSK3β、p-NF-κB p65表达均较模型组显著下降，提示SIN减轻肾移植大鼠急性排斥反应可能是与抑制ERK1／2-GSK3β-NF-κB信号通路有关。通过降低ERK1／2磷酸化水平，进而抑制其下游GSK3β活化，减轻炎症反应，减轻移植术后排斥反应。

综上所述，SIN具有一定抗肾移植大鼠移植术后急性排斥反应的作用，可能是通过阻滞ERK1／2-GSK3β-NF-κB信号通路活化发挥抑制作用，为临床治疗肾移植术后急性排斥反应提供一定实验依据。