广西玉林火龙果炭疽病病原菌的分离与鉴定

马文娟，刘月廉，梁拾睿

（1.广西壮族自治区兴业县土壤肥料工作站 兴业县 537800；2.广东海洋大学滨海农业学院 湛江市 524088；3.兴业县大平山镇人民政府 兴业县 537800；）

火龙果（Hylocereus undulatusBritt）是深受人们喜爱的热带水果之一。20 世纪90 年代初开始引进台湾试种, 并驯化改良, 在广东、海南、福建、广西等省区陆续引种栽培。据不完全统计，火龙果已被广西列入“十三五”重点发展水果品种之一，到2020 年，广西计划种植火龙果面积达到13 300 ha，产量突破500 000 t[1]。火龙果种植在玉林市也在兴起，到2020年底，全市发展火龙果面积近1 333.33 ha，其中兴业县155.33 ha（兴业县农业农村局提供数据）。随着种植面积不断扩大，病害问题日益突出，严重影响了火龙果的产量和质量。目前国内报道的火龙果病害主要有溃疡病（Neoscytalidium dimidiatum）、炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides，C.truncatum和Gloeosporiumsp.）、果 腐 病（Bipolarisca ctivora）、枯萎 病（Fusarium oxysporum）、黑斑病（Alternariasp.）和枯斑病（Nectriellasp.）等[2-3]，已有研究表明，引起贵州和海南火龙果炭疽病的病原为胶孢炭疽菌（C.gloeosporioides）和平头炭疽菌（C.truncatum）[2,4]。而引起广西钦州火龙果炭疽病的病原为盘圆孢属（Gloeosporiumsp.）[5]。当前国外报道引起火龙果炭疽病的病原主要为C.siamense（印度）、C.fructicola（菲律宾）、C.aenigma和C.siamense（泰国）、C.karstii（巴西）、C.gloeosporioides（美国和日本）[6-11]。

2020 年5 月，在广西玉林兴业县太平镇火龙果种植区发生了严重的炭疽病，发病率约为25%，通过初步采样研究，发现与国内报道的病原不同，为了明确该病原种类，本研究开展了该病害的病原鉴定，旨在为该病害的防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病害调查及样本采集

2020年4 月，在广西玉林兴业县太平镇火龙果种植区（22°94′97′N,109°91′79′E）针对火龙果枝条（茎）炭疽病进行病情调查及采样，同时采集健康无病枝条（茎），分别置于PE无菌采样袋，带回广东海洋大学滨海农业学院植保实验室进行研究。

1.2 菌株的分离与纯化

选取感病的火龙果枝条（茎），病健交界处剪取2 mm×2 mm 的小块，70%乙醇消毒30 s，然后将其转入0.1%升汞消毒1 min，用无菌水清洗3遍后，用灭菌滤纸吸干, 置于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上28 ℃培养。3~5 d后，待分离物上长出菌丝，挑取菌落边缘接种在新的PDA 平板纯化培养，然后将纯化菌株进行稀释平板涂布，获得单菌落，并接入斜面试管中在25 ℃培养3~5 d，然后置于4 ℃下保存备用。

1.3 菌株的致病性测定

将PDA 上培养7d的分离菌株，用直径5 mm的打孔器制取菌饼，然后把菌饼接种于有伤口的离体火龙果枝条（茎）上，以无菌PDA 培养基无菌饼作为对照，置于用无菌滤纸保湿的塑料盒中，保湿7~10 d。症状表现后，从接种发病的病斑上再次分离病原菌并进行形态鉴定。

1.4 致病菌株的鉴定

1.4.1 形态学特征

将致病菌株接种至PDA平板培养基，于28 ℃恒温箱暗培养，定期观察致病菌株的菌落生长，记录菌落的颜色、形态及生长情况，在光学显微镜下拍照记录致病菌株的分显微形态。

1.4.2 分子生物学鉴定

致病菌株基因组DNA 提取参考Lu 等的方法提取病原菌的DNA[12]。对病原真菌的核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer, ITS）、肌动蛋白基因（actin gene,ACT）、几丁质合成酶A 基因（chitin synthase A gene,CHS-1）和3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene,GAPDH）[13]进行PCR 扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测其PCR 产物。PCR 产物经纯化、回收后，送到广州华大测序中心进行测序。将测序序列向GenBank 数据库提交，并获得登录号。同时将序列在NCBI 上进行Blast 比对，并选取同源性较高和模式菌株序列按ITS、ACT、CHS-1和GAPDH顺序进行连接，用MEGA7.0 中的最大似然法（Maximum Likelihood）构建系统发育树，并用bootstrap对系统发育树进行检验，1 000次重复[14]，确定病原菌的分类地位。

2 结果与分析

2.1 火龙果炭疽病病情调查及发病症状

通过对约0.667 ha火龙果园的田间调查，火龙果炭疽病的发病率约为25%。该病田间主要为害枝条（茎），初期为淡黄色近圆形点状病斑，后期为黄褐色至黑褐色近圆形斑，病斑中央凹陷，边缘呈轮纹状，且表面着生褐色小点，呈典型炭疽病症状，如图1所示。病斑不限于枝条（茎）的尖部或边缘（图1-a）。

图1 火龙果炭疽病

2.2 分离的菌株

通过病样的分离，纯化，单孢分离，获得单孢菌株3 个，分别编号为HUCS-1、HUCS-2 和HUCS-3。分别对3个菌株进行进一步的研究。

2.3 菌株的致病性

菌株HUCS-1、HUCS-2 和HUCS-3 分别接种于健康枝条（茎），5 d 后开始发病，所有接种部位均变黑腐烂并凹陷（图1-b），其发病症状与田间采集样品症状相似，而对照未发病（图1-c）。对接种后发病组织进行再次分离纯化，获得的菌株与接种菌株形态特征一致。说明所分离的菌株HUCS-1、HUCS-2 和HUCS-3均为致病菌。

2.4 病原菌形态特征

在28 ℃条件下，菌株HUCS-1、HUCS-2 和HUCS-3在PDA培养基上菌落呈白色至灰色，分生孢子为单细胞，透明、柱状、两端钝化，大小为（13.8~16.5） μm×（4.0~5.5） μm（n=50）。附着胞呈椭圆形至不规则形，呈暗褐色，大小在（5.6~8.5） μm×（4.5~6.5） μm 之间（n=20）（图1-d 和e）。菌株形态特征与已报道文献中暹罗刺盘孢菌（Colletotrichum siamense）的描述一致[15]。

2.5 致病菌株的分子生物学特性

菌株HUCS-1、HUCS-2 和HUCS-3 经过PCR扩增、测序以及向GenBank 数据库提交序列，获得登录号，按顺序分别是MZ723903、MZ723904和MZ723905 （ITS）；MZ736568、MZ736569 和MZ736570 （ACT）； MZ736571、 MZ736572 和MZ736573 （CHS-I）；MZ736574、MZ736574 和MZ736574（GAPDH）。

将所得序列进行BLAST 比对，结果显示，致病菌株的ITS、ACT、CHS-I和GAPDH序列与C.siamense的 模 式 菌 株ICMP 18578 （JX010171，FJ907423、JX009865 和JX009924）和其他多个菌株同源性达到99%~100%。基于ITS、ACT、CHSI和GAPDH基因，从GenBank中选取的序列，采用最大似然法，构建系统发育树，如图2所示，菌株HUCS-1、HUCS-2 和HUCS-3 与 模式菌株ICMP 18578聚在同一分支，而与其他种有较大的遗传距离（图2）。

图2 系统发育树

综合分离菌株的形态学特征、致病性测定和多基因序列分析，确定引起广西玉林兴业县太平镇火龙果种植区的炭疽病为暹罗刺盘孢菌（C.siamense）。

3 讨论与结论

炭疽病是植物最常见病害之一，但其病原种类复杂，多样性高，仅用形态学或单基因分析难以明确其分类地位[12]。因此，采用ITS、ACT、CHS-I和GAPDH的多基因序列分析能更科学地明确病原菌的分类地位，这将有助于在生产上对该病害的有效管理。本研究综合分离菌株的形态学特征、致病性测定和多基因序列分析，确定引起广西玉林兴业县太平镇火龙果种植区的炭疽病为暹罗刺盘孢菌（C.siamense），是国内的首次报道。