大豆卵磷脂中二亚油酰磷脂酰胆碱的分离纯化

刘思敏，从艳霞，黄俊圻，陈 欢，龚 任,李 冰, 张海龙,齐玉堂，张维农

(1.武汉轻工大学 食品科学与工程学院，武汉430023； 2.国粮武汉科学研究设计院有限公司，武汉430079)

二亚油酰磷脂酰胆碱(DLPC)是大豆卵磷脂(PC)的主要活性成分[1]，具有抗氧化[2]、预防纤维化[3]、抗炎、调节细胞凋亡、修复和保护细胞膜[4]等独特的药用价值及特殊生理功能。但天然存在的DLPC含量并不高，以大豆磷脂为例，其中的DLPC含量仅为10%左右。

国内外对磷脂的研究多集中在磷脂大类及磷脂酰胆碱(PC)分子种类的高效液相色谱检测方法和营养功能上[5-10]，对特异性磷脂分子(如DLPC、二油酰磷脂酰胆碱这类具有特定脂肪酰种类和位置的磷脂分子)的分离纯化以及合成的相关报道较少。史苏佳等[11]提出用正相硅胶柱纯化二亚麻酰磷脂酰胆碱，但未提及对DLPC的纯化程度，且以正己烷-甲醇-水作为洗脱剂，不利于回收，同时也不利于产品安全和环境友好[12]。酶法合成DLPC具有反应条件温和、溶剂使用量少的特点，但目前该法对DLPC含量提高有限。因此，寻找一种高效、绿色环保的方法制备高纯度DLPC具有很好的经济效益与社会价值。本文以大豆粉末磷脂为原料，经95%乙醇溶液处理后，得到高纯度的磷脂酰胆碱，再将磷脂酰胆碱溶于乙醇，用反相C18柱进行分离。考虑到甲醇在有机溶剂中价格低廉，而乙醇在食品加工中无毒无害，本研究考察了甲醇和乙醇作为洗脱剂对DLPC的分离纯化效果，以期为制备高纯度的DLPC提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

大豆粉末磷脂(PC含量30%，DLPC含量8.5%)，安徽素之味生物科技有限公司；无水乙醇、乙醚、丙酮、甘油、乙酸铵，均为分析纯；甲醇、正己烷、无水乙醇，均为色谱纯；L-α-磷脂酰胆碱标准品(纯度≥98%)，百灵威科技有限公司；1,2-二亚油酰基-3-sn-磷脂酰胆碱(DLPC，纯度≥99%)，美国Sigma公司。

1.1.2 仪器与设备

CHEETAHTMMP 100/200中压快速纯化制备系统、中压制备型Claricep Flash C18色谱柱(20～35 μm，100 Å，40 g)、Venusil XBP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，博纳艾杰尔公司； Waters2996高效液相色谱仪(PDA 检测器)、Waters1525 二元 HPLC 泵，Waters公司；ME204/02 电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；YRE2000E旋转蒸发仪，巩义市予华仪器有限责任公司；DF-101S型集热式恒温磁力搅拌器，常州国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 DLPC的分离纯化

以大豆粉末磷脂为原料，DLPC的分离纯化工艺流程如图1所示。

1.2.1.1 原料预处理

取20 g大豆粉末磷脂于烧杯中，加入40 mL 95%的乙醇溶液，在50℃水浴中加热搅拌均匀，静置，收集上清液，于50℃旋转蒸发除去溶剂，得到磷脂酰胆碱粗提物。取5 g磷脂酰胆碱粗提物于具塞圆底烧瓶中，加入20 mL 95%的乙醇溶液，于60℃加热搅拌溶解，降温至-7℃，保温24 h，直接收集上清液，于50℃旋转蒸发除去溶剂，得到高纯度的磷脂酰胆碱(磷脂酰胆碱含量为90%，其中DLPC含量为28%)。

1.2.1.2 反相C18色谱柱分离纯化DLPC

采用中压制备型Claricep Flash C18色谱柱对磷脂酰胆碱中的DLPC进行分离纯化。将1.2.1.1制备的磷脂酰胆碱溶解于乙醇中(料溶比0.5∶1)，以此作为上样原料进行上样，然后用洗脱剂进行洗脱，每10 mL收集一玻璃试管，采用HPLC分析DLPC的纯度，合并DPLC纯度大于50%的洗脱液，真空脱溶得产品DLPC。

1.2.2 DLPC的HPLC测定[8]

1.2.2.1 标准曲线的制作

分别配制质量浓度梯度为0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL的DLPC标准溶液, 经0.22 μm尼龙滤膜过滤后，进行HPLC分析。以峰面积(Y)为纵坐标，DLPC的质量浓度(X)为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程(Y=13 074 294.896 8X+151 506.853 7，r2=0.997)。

HPLC分析条件：Venusil XBP C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-正己烷-0.05 mol/L乙酸铵-甘油(体积比84∶6∶8∶0.6)；检测波长203 nm；流速1 mL/min；柱温35℃；进样量20 μL。

1.2.2.2 样品处理及测定

对于洗脱液，直接取1 mL经0.22 μm尼龙滤膜过滤后进行HPLC分析。对于DLPC产品，取50 mg DLPC产品，用3 mL乙醇溶解并定容于25 mL 容量瓶中，再取1 mL经0.22 μm尼龙滤膜过滤后进行HPLC分析。采用面积归一化法计算DLPC的纯度。将样品中DLPC的峰面积代入1.2.2.1标准曲线回归方程，得到DLPC含量。分别按式(1)和式(2)计算洗脱液和DLPC产品中DLPC的得率。

Y1=c1V1/m×100%

(1)

式中：Y1为洗脱液中DLPC得率；c1为洗脱液中DLPC含量，mg/mL；V1为洗脱液体积，mL；m为上样量，mg。

Y2=c2V2/m

(2)

式中：Y2为产品中DLPC得率；c2为产品乙醇溶解液中DLPC含量，mg/mL；V2为定容体积，mL；m为上样量，mg。

2 结果与讨论

2.1 甲醇洗脱体系对DLPC分离纯化的影响

2.1.1 洗脱流速的影响

在柱分离过程中洗脱流速是影响分离效果和成本的重要因素，洗脱流速过快时，样品来不及平衡，影响分离效果；洗脱流速过慢时，会导致柱内扩散现象严重，同样会影响分离效果[13]。此外，洗脱流速过快或者过慢还可能造成溶剂消耗量过大，增加生产成本。因此，有必要确立适宜的洗脱流速。本实验以甲醇作为洗脱剂，固定上样量为0.5 g(以40 g C18柱填充材料为基准，下同)，在洗脱流速分别为12、20、28 mL/min时，对合并洗脱液的DLPC纯度和得率进行分析，结果分别如图1和表1所示。

图1 甲醇洗脱体系下不同洗脱流速时的色谱图

表1 甲醇洗脱体系下洗脱流速对DLPC分离效果的影响

由图1可见，随着洗脱流速的加快，DLPC在更短的时间内被洗脱出来，但不同结构的磷脂酰胆碱分离效果变差。由表1可知，随着洗脱流速的增加，DLPC纯度降低，得率升高。洗脱流速为20、28 mL/min时，DLPC纯度分别为85.1%和83.7%，二者纯度相差不大，同时二者溶剂消耗量接近；但洗脱流速为28 mL/min时DLPC得率更高，且洗脱时间更短。相比之下，以28 mL/min的洗脱流速进行洗脱在生产上更具有实际价值。

2.1.2 甲醇体积分数的影响

在反相柱分离系统中，洗脱剂中添加适量水分能提高分离效果，但水分含量过高会使反相柱的保留性能大大减弱[14]。本实验中固定洗脱流速为28 mL/min，上样量为0.5 g，以不同体积分数的甲醇为洗脱剂，对合并洗脱液的DLPC纯度和得率进行分析，结果如图2和表2所示。

图2 甲醇洗脱体系下不同甲醇体积分数时的色谱图

表2 甲醇洗脱体系下甲醇体积分数对DLPC分离效果的影响

由表2和图2可见，随着甲醇体积分数的降低，DLPC纯度提高，在甲醇体积分数为90%时，DLPC纯度高达95.5%，与 95%的甲醇相比，以90%甲醇作为洗脱剂进行洗脱时，其纯度提高不到2百分点，但洗脱时间延长了3倍，溶剂消耗量增加了3倍。综合考虑，95%甲醇更适合作为DLPC的洗脱剂。

2.1.3 上样量的影响

在制备液相色谱中，样品的上样量是影响分离效果的重要因素之一。固定相负载样品的能力是一定的，上样量过多或者过少都不利于分离。上样量过小，分离效率变低；上样量过大，会导致相邻峰的分离度降低，甚至重叠在一起无法分离，分离效果变差[15]。本实验以95%甲醇为洗脱剂，固定洗脱流速为28 mL/min，以不同的上样量进行上样，对合并洗脱液的DLPC纯度和得率进行分析，结果如图3和表3所示。

图3 甲醇洗脱体系下不同上样量时的色谱图

由图3可见，不同上样量下DLPC的洗脱时间无明显差异。由表3可见，整体来看随着上样量的增加，DLPC纯度呈下降趋势，而得率呈升高趋势。考虑到将该方法投入到生产中应尽可能提高样品处理量，选择0.5 g上样量，既达到DLPC较高纯度的要求，又达到更高产量的要求。

表3 甲醇洗脱体系下上样量对DLPC分离效果的影响

2.2 乙醇洗脱体系对DLPC分离纯化的影响

2.2.1 洗脱流速的影响

按2.1.1分离条件，将洗脱剂甲醇换为乙醇，考察不同洗脱流速对DLPC分离效果的影响，结果如图4和表4 所示。

图4 乙醇洗脱体系下不同洗脱流速时的色谱图

表4 乙醇洗脱体系下洗脱流速对DLPC分离效果的影响

由图4可见，乙醇作为洗脱剂时，不同结构的磷脂酰胆碱重叠在一个峰上，无法分离。与甲醇相比，乙醇极性更弱，洗脱能力更强，磷脂酰胆碱更快流出，导致分离效果变差。由表4可见，在3种洗脱流速下，DLPC纯度介于50% ～ 60%之间，得率介于21%～ 24%之间。综合考虑效率和成本，选择洗脱流速为28 mL/min。

2.2.2 乙醇体积分数的影响

相较甲醇洗脱体系，乙醇对磷脂酰胆碱洗脱能力更强，为了提高分离效果，需考虑更高水分含量对DLPC分离效果的影响。按2.1.2分离条件，将洗脱剂不同体积分数的甲醇换成不同体积分数的乙醇，考察乙醇体积分数对DLPC分离效果的影响，结果如图5和表5所示。

图5 乙醇洗脱体系下不同乙醇体积分数时的色谱图

表5 乙醇洗脱体系下乙醇体积分数对DLPC分离效果的影响

由图5和表5可见，随着乙醇体积分数的降低，DLPC分离效果得到明显改善。乙醇体积分数为90%时，DLPC纯度仅为77.7%，远未达到高纯度磷脂酰胆碱的要求；而乙醇体积分数为80%时，DLPC纯度可达96.1%。因此，选择80%乙醇作为洗脱剂。

2.2.3 上样量的影响

以80%乙醇为洗脱剂，固定洗脱流速为28 mL/min，考察上样量对DLPC分离效果的影响，结果如图6和表6所示。

图6 乙醇洗脱体系下不同上样量时的色谱图

表6 乙醇洗脱体系下上样量对DLPC分离效果的影响

由图6可见，不同上样量下DLPC的洗脱时间无明显差异。由表6可见，随着上样量的增加，DLPC的纯度略有下降，但都高于90%，上样量0.75 g 与0.50 g相比，得率上升不到2百分点。综合考虑分离效果和成本，选择上样量为0.75 g。

2.3 最优条件下产品纯度和得率

对优化的甲醇洗脱体系(95%甲醇，洗脱流速28 mL/min，上样量0.5 g)和乙醇洗脱体系(80%乙醇，洗脱流速28 mL/min，上样量0.75 g)下产品DLPC的纯度和得率进行检测，结果表明，甲醇洗脱体系得到的产品DLPC纯度为91.2%，得率为21.5%，乙醇洗脱体系得到的产品DLPC纯度为92.6%，得率为20.1%。与优化的甲醇洗脱体系相比，乙醇洗脱体系得到的DLPC纯度更高，但得率有所下降，溶剂消耗量也更大。实际工业生产，需结合标准和法规选择合适的洗脱体系。

3 结 论

以大豆粉末磷脂为原料提取磷脂酰胆碱，再采用反相制备色谱系统从磷脂酰胆碱中分离纯化DLPC，以不同体积分数的甲醇或者乙醇作为洗脱剂均可实现DLPC的分离纯化，其纯度均能达到90%以上。本实验采用的中压柱色谱分离技术易于工业化，分离效果好，本研究结果将利于推进DLPC的制备及应用。