油茶蒲醇提纯化物的组分鉴别及对油脂的抗氧化作用

董熠辉，吴苏喜,，李 彪，李普选

(1.长沙理工大学 食品与生物工程学院，长沙 410114; 2.郑州远洋油脂工程技术有限公司，郑州 450000)

目前，生产企业为预防油脂酸败、延长产品货架期，常在油脂产品中添加化学合成抗氧化剂，而化学合成抗氧化剂有一定的安全隐患[1-2]。从天然植物资源中寻求高效无害的天然抗氧化剂是近年来油脂科研人员所追求的研究方向之一。

油茶蒲(也叫油茶果壳)是油茶产业的主要副产物，占油茶果的2/3，年产量达200多万t[3]。油茶蒲含有多种天然的抗氧化活性成分，如黄酮[4]、多酚[5]、皂苷[6]等，近年来其已成为科研人员研究开发天然抗氧化剂的重要资源[7]。然而，目前人们只是研究了油茶蒲提取物对DPPH自由基的清除能力、对Fe2+的螯合能力和总还原力等[8]，而在油脂工业生产和实际生活中并未得到合理利用。本试验在前期研究油茶蒲黄酮提取工艺及其抗氧化活性[9]的基础上，研究油茶蒲醇提物对于常见的几种不同类型食用油的抗氧化作用，以期对提高油茶副产物综合利用率、开发出油茶蒲基天然抗氧化剂提供指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

油茶蒲，由湖南省康多利油脂有限公司提供的油茶鲜果经阴干、裂果、烘干而得；菜籽油和核桃油，采用ZYJ-9018榨油机的清香模式压榨制得，分别符合菜籽油和核桃油的国标一级标准；油茶籽油 (国标一级)，由湖南殷理基油脂有限公司提供。

S-8大孔树脂，天津浩聚树脂科技有限公司；没食子酸、芦丁、槲皮素、儿茶素、表儿茶素5种标准品(纯度≥98%)，中国医药上海化学试剂公司；TBHQ(食品级)，翁源广业清怡食品科技有限公司；甲醇、乙腈，均为色谱纯；无水乙醇、石油醚、三氯化铁、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等，均为分析纯。

岛津LC-20AT高效液相色谱仪；ZYJ-9018榨油机，德国贝尔斯顿；TDL-36C离心机；ACO电磁式空气泵；UV 5200 型紫外可见分光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 油茶蒲醇提物的制备

称取2 g左右过0.18 mm(80目)筛的油茶蒲粉末(W0)于锥形瓶，按照料液比1∶20加入60%乙醇溶液，在60℃下以240 W超声功率辅助浸提40 min，趁热抽滤，于50℃下旋蒸浓缩到适当程度，将浓缩液冷冻干燥，得到油茶蒲醇提物，称重(W1)，备存。

1.2.2 油茶蒲醇提物的纯化

用S-8大孔树脂，按照文献[10]的方法进行预处理和装柱；将油茶蒲醇提物配制成4 mg/mL溶液，过柱[11]，然后用60%乙醇洗脱，收集洗脱液，旋蒸浓缩，将浓缩液冷冻干燥，得到油茶蒲醇提纯化物(简称POSE)，称重(W2)，备用。

1.2.3 样品总黄酮含量的测定

1.2.3.1 芦丁标准曲线的制作

参考吴苏喜等[9]的方法，以乙醇为溶剂配制306 μg/mL芦丁原液。分别准确移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL芦丁原液于10 mL比色管中，加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，静置6 min后，加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液，静置6 min，再加入4.0 mL 4% NaOH溶液，摇匀，用水定容至10 mL，静置15 min；用紫外可见分光光度计于510 nm波长处测定其吸光度，以蒸馏水为空白调零。以芦丁质量浓度(X)为横坐标、吸光度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为Y=0.001 1X+0.003 4，R2=0.999 6。

1.2.3.2 样品中总黄酮的提取

实验室前期研究[9]发现60%丙酮溶液对于油茶蒲黄酮的提取具有显著优势，故用60%丙酮溶液为溶剂。取0.1 g左右待测样(油茶蒲、其醇提物粗样或醇提纯化物，Mi)，在料液比1∶50 、温度60℃、超声功率240 W条件下辅助浸提40 min，趁热抽滤、洗涤，汇集滤液和洗涤液，用60%丙酮定容至一定体积(Vi)，得到相应样品的黄酮测试液。

1.2.3.3 总黄酮含量的测定

取1.0 mL黄酮测试液置于10 mL比色管内，按1.2.3.1操作，测定吸光度(Ai)，根据回归方程计算测试液中的总黄酮质量浓度(Ci)，再根据稀释倍数计算测试固样中总黄酮含量、质量、回收率和得率。

(1)

Pi=Qi×Wi

(2)

(3)

(4)

式中：Qi为样品的总黄酮含量；Ci为样液中总黄酮质量浓度，μg/mL；Vi为样液总体积，mL；Mi为样品质量，g；Pi为样品中的总黄酮质量，g；Wi为样品总质量，g；Ni为制备过程中样品的总黄酮回收率；Ri为制备过程中样品的总黄酮得率(i可取0,1,2，i=0时为油茶蒲原料，i=1时为油茶蒲醇提物粗品，i=2时为POSE)。

1.2.4 HPLC法测定POSE中抗氧化成分含量

1.2.4.1 绘制标准工作曲线

分别称取没食子酸、槲皮素、儿茶素、表儿茶素和芦丁标准品10 mg，用甲醇定容至10 mL，配制成1 mg/mL的标准储备液；各取1 mL标准储备液，混合，用甲醇定容至10 mL，配制成100 μg/mL的混标工作液；再稀释成质量浓度分别为1、5、10、20、100 μg/mL 的混标测试液，过0.45 μm滤膜，进行HPLC检测。以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。

1.2.4.2 样品测定

取POSE测试液，过0.45 μm滤膜，进行HPLC检测。根据峰面积和标准工作曲线计算POSE中抗氧化成分含量。

1.2.4.3 HPLC分析条件

C18色谱柱(250 mm×4.60 mm,5 μm)；柱温40℃；进样量10 μL； 流速1.0 mL/min；紫外检测器，波长254 nm；流动相 A为乙腈，流动相B为纯水； 梯度洗脱程序为0～5 min 20% A，5～15 min 20%～85% A，15～19 min 85% A，19～19.01 min 85%～20% A，19.01～27 min 20% A。

1.2.5 POSE对食用油氧化稳定性的影响

称取6份100 g油样，分别置于1～6号250 mL锥形瓶中。按照0.00%、0.01%、0.05%、0.10%、0.20%添加量向1～5号瓶中添加POSE，向6号瓶中添加0.01% TBHQ作为阳性对照，超声混合均匀。然后，将锥形瓶放入恒温干燥箱中，通过干燥箱的排气孔插入玻璃导气管，该导气管上端依次与气体流量计和电磁式空气泵相连，下端插入锥形瓶底部。将干燥箱温度设定为97.8℃(参考AOM法)[12]，开动空气泵，以3 mL/s流速向锥形瓶通入空气。从第12 h开始(核桃油从0 h开始)，每隔3 h测定油脂的酸值(参照GB 5009.229—2016)，取3次测定的平均值。

1.2.6 数据分析

采用SPSS 17.0和Origin 2018C系统进行数据处理和分析。

2 结果与分析

2.1 油茶蒲原料的总黄酮含量与纯化过程中的总黄酮回收率及得率

油茶蒲基各样品的总黄酮含量与提取纯化过程中总黄酮回收率及得率见表1。

表1 油茶蒲基样品的总黄酮含量、回收率和得率

从表1可知：2 g原料油茶蒲以60%乙醇提取，可获得0.46 g油茶蒲醇提物，该醇提物通过S-8大孔树脂纯化，可得0.14 g POSE；原料油茶蒲总黄酮含量为7.04%，其醇提物中总黄酮含量为22.41%，经过纯化后，总黄酮含量提高到66.86%；醇提可使总黄酮回收率达74.57%，纯化可使总黄酮回收率达89.14%；相对油茶蒲原料而言，经过醇提的总黄酮得率达5.25%，再经过纯化处理后总黄酮得率为4.68%。说明醇提和纯化处理可以有效地获得油茶蒲原料中的黄酮。

2.2 POSE中功能活性成分的鉴定

选用植物皮壳中最常见的5种生物活性成分为标样，采用HPLC法对POSE中的功能活性成分进行定性定量分析，结果见表2。

表2 POSE的活性成分含量 mg/g

由表2可知，POSE中鉴定出没食子酸 18.83 mg/g、儿茶素26.12 mg/g、表儿茶素 27.64 mg/g、芦丁16.13 mg/g、槲皮素0.52 mg/g。可见，POSE中富含表儿茶素、儿茶素、芦丁等多种黄酮类物质以及没食子酸(其他成分可能为山奈苷[13]、鞣花酸[14]、花青素[15]等)。黄酮类化合物具有优良的抗氧化活性及多种药理和保健性能[16]，没食子酸对于食用油的抗氧化具有增效作用[17]。因此，POSE具有作为天然植物抗氧化剂开发使用的潜在价值。

2.3 POSE对不同类型油脂的抗氧化作用

2.3.1 不同剂量POSE对油茶籽油酸值的影响(见图1)

从图1可知，空白油茶籽油和添加0.01% POSE的油茶籽油酸值的突增临界点为加热18 h，添加0.05%、0.10%和0.20% POSE的油茶籽油酸值突增临界点推迟到30 h，说明POSE的添加对于油茶籽油酸值的增长具有剂量正相关的抑制作用。加热39 h内0.20% POSE与0.01%TBHQ对油茶籽油酸值增长的抑制作用相当。

图1 POSE对油茶籽油酸值的影响

2.3.2 不同剂量POSE对菜籽油酸值的影响(见图2)

图2 POSE对菜籽油酸值的影响

从图2可知，POSE对菜籽油酸值的抑制能力具有一定的剂量依赖性。空白菜籽油和添加0.01%、0.05%和0.10% POSE的菜籽油酸值突增临界点为加热15 h，添加0.20% POSE的菜籽油酸值突增临界点推迟到24 h，而添加0.01% TBHQ的菜籽油酸值突增临界点达到33 h。这说明POSE对于菜籽油有一定的抗氧化效果，但与TBHQ存在一定差距。

2.3.3 不同剂量POSE对核桃油酸值的影响(见图3)

图3 POSE对核桃油酸值的影响

从图3可知，POSE对核桃油酸值的增长抑制作用很强，具有剂量正相关的抑制作用。空白核桃油的酸值突增临界点是加热12 h，添加0.01%、0.05%、0.10%和0.20% POSE的核桃油酸值均缓慢平稳增长，直到加热24 h后才出现突增迹象。在加热24 h后，添加0.20% POSE的核桃油酸值明显低于添加0.01% TBHQ的核桃油；加热30 h后，添加0.10% POSE与添加0.01% TBHQ对核桃油酸值抑制能力相当。

2.3.4 讨论

试验发现，要达到与添加0.01%TBHQ相当的抗氧化效果，油茶籽油、菜籽油和核桃油中分别需要添加0.20%、0.20%以上和0.10%～0.20%的POSE，说明核桃油对POSE的敏感度最高。

POSE在油脂中主要起到两方面的抗氧化作用：一是POSE中富含酚羟基的黄酮类物质具有清除自由基的能力[18]，从而阻断了油脂的自动氧化进程；二是POSE中的黄酮类、有机酸等活性成分易于螯合金属离子[11,19-20]，生成金属盐，使油脂中的金属离子钝化，不能引发自由基链反应。由此可见，相较于油茶籽油与菜籽油， POSE对核桃油表现出更加优良抗氧化作用的原因可能是在油脂制备过程中，有部分金属离子进入油脂中，核桃油富含多不饱和脂肪酸(70%以上[21])，极易受金属离子催化氧化，而POSE中的功能性活性成分对于金属离子具有很强的螯合能力[11,20]，从而提高了核桃油的抗氧化活性。

3 结 论

经过S-8大孔树脂纯化，POSE的总黄酮含量由纯化前的22.41% 提高到66.86%；从POSE中初步鉴定出5种活性成分，分别为没食子酸、儿茶素、表儿茶素、芦丁、槲皮素，其他组分有待进一步鉴定；POSE对多不饱和脂肪酸含量高的核桃油具有较好的抗氧化作用，且对于植物油的抗氧化作用与植物油中多不饱和脂肪酸含量存在一定正相关性，这对于高不饱和脂肪酸型油脂的天然抗氧化剂开发具有一定的指导意义。