酸价的特异性检测方法——铜皂络合比色技术的研究进展

曹文明， 薛 斌, 屠炳芳

(1.上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海食品快速检测工程技术研究中心，上海 200093； 2.丰益(上海)生物技术研发中心有限公司，上海 200137； 3.月旭科技(上海)股份有限公司，上海 201613； 4.贝雷(上海)生物科技有限公司，上海 201203)

酸价(acid value，AV)反映油脂中游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)含量，是油脂最重要的质量等级指标之一，也是食用油脂和含油食品的安全指标。自1940年美国油脂化学家学会(American Oil Chemists Society, AOCS)颁布酸碱中和滴定法测定酸价以来，该酸价测定方法相继被全球各标准化组织采用。由于酸碱中和滴定技术无法区分非FFA的有机酸和无机酸[1]，是FFA的非特异性检测方法，当应用于含油食品等复杂基质的酸价测定时，酸价正偏差的检测结果极大地困扰食品行业。对于特异性定量测定FFA的技术，较系统的研究报道仅限于金属络合法，其中最具代表性的是铜皂络合比色法，其技术雏形始于20世纪50年代。近70年来，因对铜皂络合理论的认识局限，以及高毒试剂、显色稳定性等技术瓶颈，铜皂络合比色法在定量检测油脂FFA、评价脂肪酶活性、脂质代谢等领域的应用受到限制。直到2020年，铜皂络合显色理论取得了新的进展，突破了长期存在的络合显色技术瓶颈，形成了具有高度特异性和稳定性的新铜皂络合比色法。本文旨在针对酸价测定的酸碱中和滴定技术的共性和非特异性的局限，阐述特异性测定FFA技术中最具代表性的铜皂络合比色法的技术演变和创新发展历程，展望新铜皂络合比色法在突破若干技术瓶颈后的应用优势，为准确定量复杂基质中FFA或酸价测定提供一种理想的特异性方法。

1 现行油脂酸价检测技术概况

1.1 酸价的本质内涵

酸价，也称酸值，是指中和1 g油脂中所有的FFA所需消耗的氢氧化钾(KOH)的质量(毫克)[1]，可反映油脂受脂肪酶等催化发生氧化水解反应的程度。制油过程中，动植物油料的天然细胞结构被破坏，同时释放出脂肪酶混合于油脂中，使油脂在加工和储存过程中可能不断地发生氧化水解反应产生FFA[2-4]。油脂中FFA总含量高，会造成油脂的烟点降低、氧化劣变加快、营养成分破坏、不良气味等负面作用。FFA总含量是反映油脂氧化水解酸败[5]最直接的标志，酸价既是食用动植物油脂及制品重要的安全指标[6-9]，也是食用植物油产品分级的主要质量指标之一。

酸价仅当表示油脂中FFA百分含量时与酸度同义，但单位不同。在我国国家标准中，其他酸度、脂肪酸值等概念都与酸价含义无关，如表1所示。

表1 国家标准中与酸价易混淆的概念

续表1

1.2 酸价测定的滴定技术共性与非特异性局限

目前国际上酸价或FFA总含量检测的标准方法[1，10，15-18]，无一例外都采用了酸碱中和滴定技术，详见表2。

表2 酸价和FFA总含量测定的标准方法

酸碱中和滴定检测技术分为3种：冷溶剂指示剂滴定、热乙醇指示剂滴定和冷溶剂自动电位滴定。AOCS Cd 3d-63、AOCS Ca 5a-40、AOAC 940.28和AOAC 969.17在其各自的应用范围内只规定了冷溶剂指示剂滴定检测技术；而ISO 660：2020却同时采用了这3种滴定技术，并规定了冷溶剂指示剂滴定检测技术和冷溶剂自动电位滴定技术均为参考方法。我国现行的酸价检测食品安全国家标准(GB 5009.229—2016)与ISO 660:2020的技术同步而应用范围各异[10]。

酸碱中和滴定不是FFA的特异性检测技术，根据酸碱中和滴定技术的基本原理[19]，油脂中所有的酸性强度大于或接近于FFA酸性强度的有机酸类物质和无机酸类物质，都会在滴定时与标准滴定溶液中的KOH或NaOH发生酸碱中和反应，导致酸价检测结果偏高。

酸碱滴定技术的非特异性弊端，对于食用动植物油脂的酸价测定影响并不大，因为一般情况下，各类食用油脂中主要的天然酸性物质就是FFA。但是，对于基质复杂的含油食品，其中的非FFA类酸性天然产物、酸性食品添加剂和酸性美拉德反应产物等(见表3)，都可能溶解于提取的油脂样品中，导致酸价检测结果偏高。薛斌等[33]研究指出，未添加食用香精香料的调味酱，其自动电位滴定法的酸价测定值与铜皂络合比色法的测定值相差无几，但添加食用香精香料的调味酱，其自动电位滴定法的酸价测定值就显著偏高。因此，铜皂络合比色法在酸价测定时可以免受酸性食用香精香料的干扰。

表3 可能存在食品中的酸性物质

2 特异性定量FFA的经典铜皂络合比色法

2.1 铜皂络合比色法的两相络合技术及其适用范围

铜皂络合比色法是一种用于测定油脂中FFA总含量的技术[34-36]，该技术是将油脂试样溶于烃类溶剂作为有机相，用吡啶-铜离子的络合离子染色液作为水相，进行液-液双相反应，反应过程中水相中的络合离子会与有机相中的各种FFA发生反应，形成三位一体的(吡啶-铜离子-脂肪酸根离子)铜皂络合物，易溶于有机相的铜皂络合物显现特殊的靛蓝色，在700 nm波长附近有特征吸收峰，且符合朗伯-比尔定律，从而可以准确定量。铜皂络合物结构以及铜皂络合反应示意图如图1和图2所示。

注：R1～R4分别为不同脂肪酸碳链。

有研究指出，铜皂络合比色法仅对C8及其以上的中长碳链FFA有显色反应，而对C8以下的短碳链脂肪酸无显色反应[33，36](FFA的碳数与FFA铜皂络合反应后吸光度的相对强度关系如图3所示)。

图3 不同碳链长度FFA铜皂络合反应后吸光度的相对强度[36]

相比于酸碱中和滴定技术，铜皂络合比色法可避免溶解在油脂中的山梨酸和苯甲酸等对酸价检测的干扰[33]。铜皂络合比色法是食用油脂中各种天然FFA的特异性检测技术。

2.2 经典铜皂络合比色法的技术演变与发展瓶颈

铜皂络合比色法研究始于20世纪50年代。 日本Iwayama[37]研究发现，在三乙醇胺存在的条件下，脂肪酸的硝酸铜溶液能够溶于氯仿，使C10～C22 的FFA所形成的铜盐转移入有机相并显现蓝色，在691 nm波长处测定吸光度，所测得的吸光度与FFA含量在7.5～150 mg/L FFA质量浓度范围内呈线性关系。这就是铜皂络合比色技术的雏形。

1964年，美国Baker[34]使用乙酸铜水溶液为水相染色液，苯作为有机相，率先应用于检测植物油脂中FFA总含量。

1976年，美国Lowry等[35]首次初步阐明了铜皂络合物的结构，建立了苯为有机相、乙酸铜水溶液(吡啶调节pH至6.0～6.2)为水相染色液的技术框架，至此经典的铜皂络合比色法基本定型并沿用至今。但是由于对铜皂络合显色理论认识的局限，过窄的pH范围(pH 6.0～6.2)使实验操作难度较大，剧毒试剂苯与替代有机相显色强度的矛盾，以及显色稳定性等因素限制了该方法的广泛应用。

1986年，韩国Kwon等[36]首次建立以异辛烷替代苯为有机相、乙酸铜-吡啶为水相的改良铜皂络合比色法，并用于测定FFA，将其应用于脂肪酶活性的研究发现，铜皂络合比色法仅适用C8以上FFA的检测，FFA碳链长度对显色强度无显著影响。但是，异辛烷替代苯为有机相，铜皂络合物显色强度锐减了2/3，灵敏度大幅下降，对固态油脂溶解稳定性差等弊端凸显。

从1976至今，经典的铜皂络合比色法测定FFA在脂肪酶活性评价、脂质组学的研究报道未曾间断，其中包括铜皂络合比色法用于谷物脂肪酸值的测定(2012年)[38]，采用铜皂络合比色法监测水产及其制品在长期储存过程中所含油脂成分中FFA总含量的变化情况以评价水产及其制品在储存过程中品质变化规律(2014—2017年)[39-41]。在酶学研究中，一直以来都采用铜皂络合比色法测定脂肪酶水解产物中FFA总含量(2011—2016年)[42-44]来评价脂肪酶的活性。2017年 Chen等[45]在运用脂质组学方法研究牡蛎在储存过程中磷脂类物质的代谢机理时发现，牡蛎的代谢产物会引起pH的变化，干扰了酸碱滴定法测定FFA的结果，而改用铜皂络合比色法测定FFA则可以避免此缺陷。

2021年报道了以低毒溶剂环己烷替代高毒的苯作为有机相，解决了用铜皂络合比色法检测固态油脂酸价的问题，并验证了酸性添加剂和食用香精对传统酸碱滴定法检测酸价的干扰。铜皂络合比色法可特异性定量复杂基质样品中油脂FFA总含量，免受非FFA的有机酸和无机酸的干扰[33]。

3 铜皂络合比色法的技术进展

3.1 铜皂络合显色理论创新

3.1.1 铜皂络合反应原理新发现

经典的铜皂络合比色法，要求铜皂染色液pH严格维持在6.0～6.2，偏离该狭窄pH区间则会导致铜皂络合显色强度大幅降低[35-36]。进一步研究发现：铜皂染色液中吡啶分子与铜离子的物质的量比(以下简称摩尔比,MR)才是决定铜皂络合显色反应的关键[46]。MR大于等于3时，无论铜皂染色液的pH如何变化，都失去了对FFA进行铜皂络合显色反应的能力。根据金属离子络合原理推导的络合机制，在水溶液中铜离子与吡啶分子形成铜-吡啶络合物离子([Cu(C5H5N)n]2+，n=1～4)，铜离子作为中心离子，可以与配位体吡啶分子络合形成1～4个不同配位数[47]的络合物。络合的吡啶分子数目越多，形成的络合物也越稳定，如表4所示。

表4 不同数目配位体的铜-吡啶络合物离子的稳定系数[47]

3.1.2 铜皂络合反应的抑制

根据表4的数据推测，铜离子、吡啶分子和FFA形成的铜皂络合物的稳定系数(lgβn)应当在(4.33, 5.93)范围内。所以，当MR在[1，3)范围时，铜皂染色液中总会存在一定量的[Cu(C5H5N)2]2+或[Cu(C5H5N)]2+络合离子，正是这些含有1个或2个吡啶配位体数的铜-吡啶络合物离子直接与FFA进行了铜皂络合反应，形成了铜皂络合物。但当MR大于等于3时，铜皂染色液中所有的铜离子与吡啶分子形成[Cu(C5H5N)3]2+或[Cu(C5H5N)4]2+，这些含有3个或4个吡啶配位体数的铜-吡啶络合物离子的络合稳定系数大于与FFA形成的铜皂络合物，从而完全抑制了铜皂络合反应。

3.1.3 铜皂络合显色理论突破

新铜皂络合比色法不必严控铜皂染色液的pH在6.0～6.2范围内的要求，论证了MR在[1，3)条件下(MR在2左右最优),铜皂染色液的pH达到6.8后(pH 6.8～7.5)显色强度最佳[46]。对新铜皂络合比色法研究证明，MR在[1，3)条件下，铜皂染色液中主体络合物离子[Cu(C5H5N)2]2+，在pH 5～7 的水溶液中不仅可有效抑制铜离子形成氢氧化铜沉淀(当pH>5时)[46]，而且不影响脂肪酸铜皂络合物的形成，而一旦MR达到3时，形成的[Cu(C5H5N)3]2+会抑制铜皂络合物的形成。

经典铜皂络合比色法用吡啶将染色液pH调节到6.0～6.2之间时，MR恰好接近2，所以本质上已将染色液MR调节到最佳。

研究表明，MR在2左右时用10%氢氧化钠水溶液不断调节升高铜皂染色液的pH，铜皂络合反应的显色强度也会随之不断地增强。一旦染色液的pH大于6.8，显色强度不再随pH的上升而明显增强[46]。其原因是各种中长碳链FFA的pH都在4.8左右[48]，属于弱酸。因此，随着铜皂染色液pH的升高，有机相中FFA的电离度不断加大，释放出FFA酸根离子的量也不断增加，导致更多的FFA酸根离子从有机相转移入水相，形成更多的铜皂络合物，铜皂络合显色强度因此不断增强，直到铜皂染色液的pH达到6.8，此时有机相中的FFA已经99%解离为FFA酸根离子。

3.2 缓冲盐染色液的增强显色与抑制乳化作用

3.2.1 促进铜皂络合物向有机相迁移而增强显色强度与稳定性

新铜皂络合比色法采用0.05～2.0 mol/L乙酸钠-乙酸缓冲液配制的铜皂染色液，降低了铜皂染色液的水活性，铜皂络合物在染色液(水相)的溶解度也相应降低，促进了络合反应后更多的铜皂络合物迁移进入有机相，从而增强了铜皂络合显色强度[46]。同时，由于缓冲液极化了铜皂络合物在水相和有机相之间的分配系数，最大程度降低了铜皂络合物在水相中的溶解度，从而缩小了铜皂络合物在水相中溶解度随温度变化的幅度，即进一步降低了温度对显色稳定性的影响。过高浓度的缓冲液(>2.0 mol/L)，不利有机相中形成的FFA酸根离子在铜皂染色液中的溶解，使其难以完全与铜皂染色液中的铜离子和吡啶接触形成铜皂络合物，反而导致铜皂络合显色强度降低[46]。

3.2.2 抑制铜皂络合反应时的乳化作用和水溶性酸性物质的干扰

从复杂基质的加工食品中提取的油脂会含有微量水溶性的酸性物质，如乙酸。对于缺乏缓冲盐的经典铜皂染色液，即使油脂样品中有极微量的乙酸，也会破坏极窄范围的pH限制，使铜皂络合显色强度出现明显的降低，一旦pH低于6.0，则显色强度剧烈下降[35-36]。新铜皂络合比色法染色液中的乙酸钠-乙酸缓冲液可高效维持稳定的pH环境,即使较高浓度的外来乙酸等酸性物也难以明显影响显色强度[46]。

相比于传统的纯水配制的铜皂染色液，用缓冲液配制的铜皂染色液，增强了铜皂染色液的离子强度，增大了水相和有机相的极性差异，因而降低了两相之间发生乳化作用的可能性。

3.3 破解非苯有机溶剂络合显色弱的难点

经典铜皂络合比色法中溶剂苯[34-35]是铜皂络合显色反应最佳的有机相溶剂，具有最强的显色强度。其他常见有机溶剂铜皂络合反应显色强度强弱顺序为苯>甲苯>邻二甲苯>间二甲苯≈对二甲苯>环己烷>C8～C16的直链烷烃≈异辛烷[46]。苯是高毒溶剂。在铜皂络合比色技术发展中，有尝试用低毒溶剂异辛烷[36]作为有机相，但其显色强度和固脂溶解稳定性较差[33，46]。研究显示，以乙酸钠-乙酸缓冲液配制的铜皂染色液为水相，用环己烷替代苯为有机相的铜皂络合比色法，其显色强度达到经典铜皂络合比色法的60%以上，完全满足定量比色的灵敏度和稳定性要求[33]。同样条件下，若用低毒的甲苯或二甲苯(略有异味)替代高毒的苯为有机相，显色强度与经典铜皂络合比色法基本相当[46]。

3.4 新铜皂比色法与传统铜皂比色法的比较

传统铜皂比色法与新铜皂比色法技术上的主要差异对比见表5。

表5 传统铜皂比色法与新铜皂比色法技术上的主要差异对比

4 结 语

在经典铜皂络合比色技术的基础上，经系统研究形成的新铜皂络合比色法，发展了吡啶-铜离子摩尔比为核心的新铜皂络合显色理论，解决了经典铜皂络合比色法显色强度易受pH变化影响、有机相只能用高毒溶剂苯才能达到高显色强度等问题，使铜皂络合比色技术的操作便捷性、稳定性、特异性显著提升。作为一种FFA的特异性检测技术，弥补了传统的酸碱中和滴定法无法区分FFA和其他油溶性酸性物质、油脂样品消耗量大等不足，更适合于复杂基质的加工食品的酸价检测，成为特异性定量FFA和AV的理想方法。