非小细胞肺癌患者血清DJ-1、sMICA水平与临床病理特征及预后的关系研究*

孔彦，田亮

（沧州市中心医院1.检验科，2.病理科，河北 沧州061001）

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占全部肺癌类型的75%～80%，尽管NSCLC治疗技术不断提高，但是病死率仍然较高，位居恶性肿瘤首位，尤其是晚期肺癌，5年生存率不到5%[1]。探讨与NSCLC 预后相关的生物学标志物有助于指导临床治疗，提高肺癌患者生存率。DJ-1 蛋白是一种高度保守的可溶性蛋白，参与多种细胞通路，同时DJ-1 作为一种癌基因，在肿瘤发生、发展过程中发挥重要作用[2]。肿瘤恶性进展的关键之一是肿瘤细胞获得逃避免疫介导而使肿瘤细胞杀伤作用减弱[3]，MHC-I 类链相关蛋白A（MICA）是NK 细胞、T 细胞表面的跨膜糖蛋白，主要发挥应激作用下的免疫应答[4]。可溶性MHC-I 类链相关蛋白A（sMICA）由MICA 脱落而成，当恶性肿瘤发生时，可在外周血清检测到sMICA 水平升高[5]。目前DJ-1、sMICA 与NSCLC 的相关报道十分少见，DJ-1、sMICA与NSCLC 预后关系尚不清楚，本研究检测NSCLC 患者血清DJ-1、sMICA 水平，探讨其与NSCLC 患者临床病理特征、预后的关系，旨在为临床治疗、预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2015年1月—2017年1月沧州市中心医院收治的77 例NSCLC 患者为NSCLC 组。其中，男性51例，女性26例；年龄51～72岁，平均（63.35±4.21）岁；吸烟史53例；肿瘤直径≥3 cm 41例，＜3 cm 36 例；病理类型：腺癌45 例，鳞癌32 例；分化程度：低中分化46 例，高分化31 例；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期35 例，Ⅲ、Ⅳ期42 例；淋巴转移23 例，远处转移19 例。另选取同期本院50 例体检健康者为对照组。其中，男性38例，女性12 例；年龄50～71 岁，平均（63.01±4.15）岁；吸烟史19 例。纳入标准：①支气管镜或空芯针肺穿刺活检病理学证实为NSCLC；②初次诊断NSCLC；③临床病理资料完整，配合随访者。排除标准：①经病理证实为其他类型肺癌；②入组前已经接受手术、化疗、放疗等治疗；③合并其他部位原发恶性肿瘤；④合并肺结核、严重肝肾功能不全。NSCLC 组年龄、性别与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；NSCLC 组吸烟史与对照组比较，差异有统计学意义（χ2=11.737，P=0.001），NSCLC 组高于对照组。本研究获医院医学伦理委员会批准，患者及其家属知情并签署知情同意书。

1.2 方法

NSCLC 患者入组后24～72 h 采集静脉血5 mL，对照组于体检当日采集，置于TG16-Ⅱ台式高速离心机（湖南平凡科技有限公司）4℃3 000 r/min 离心20 min（离心半径10 cm），取血清保存于-70℃低温冰箱（美国Thermo 公司），48 h 内完成待检。取出样本后，4℃缓慢复融，采用RT6000 酶标仪（深圳霄杜生命科学有限公司），应用酶链免疫吸附试验检测血清DJ-1、sMICA 水平，试剂盒购自上海博华生物试剂公司。上述检验均由本院检验中心完成，试剂批内变异控制在6.0%以内。

1.3 随访

所有NSCLC 患者均定期随访至2020年1月，每3 个月随访1 次，随访以门诊复查、电话或微信形式进行。以肿瘤复发、转移、死亡为预后不良，统计随访期间患者无疾病进展生存（progression-free survival, PFS）和总体生存（overall survival, OS）情况。PFS 定义为自病理确诊至肿瘤复发、转移、死亡的时间。OS 定义为自病理确诊至各种原因引起的死亡的时间。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以构成比（%）表示，比较用χ2检验；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log rank χ2检验；影响因素的分析采用Cox 回归模型。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清DJ-1、sMICA水平比较

两组血清sMICA、DJ-1 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），NSCLC 组高于对照组。见表1。

表1 两组血清DJ-1、sMICA水平比较 （±s）

表1 两组血清DJ-1、sMICA水平比较 （±s）

组别n DJ-1/（ng/mL）sMICA/（pg/mL）NSCLC组对照组t 值P 值77 50 18.24±3.19 4.12±1.03 36.054 0.000 146.35±22.16 31.26±7.05 42.390 0.000

2.2 血清DJ-1、sMICA 水平与NSCLC 患者临床病理特征的关系

不同临床病理特征NSCLC 患者血清DJ-1、sMICA 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），低中度分化、有淋巴转移、有远处转移患者血清DJ-1 水平均高于高度分化、无淋巴转移、无远处转移患者；TNM 分期Ⅲ和Ⅳ期、低中度分化、有淋巴转移患者血清sMICA 水平均高于TNM 分期Ⅰ和Ⅱ期、高度分化、无淋巴转移患者。见表2。

表2 不同临床病理特征NSCLC患者血清DJ-1、sMICA水平的比较 （±s）

表2 不同临床病理特征NSCLC患者血清DJ-1、sMICA水平的比较 （±s）

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2.3 不同血清DJ-1、sMICA 水平NSCLC 患者的预后

建立NSCLC 患者Kaplan-Meier 生存分析模型，根据DJ-1、sMICA 均值将NSCLC 患者分为高DJ-1水平组36 例（DJ-1≥18.24 ng/mL），低DJ-1 水平组41 例（DJ-1 ＜18.24 ng/mL）、高sMICA 水平组43 例（sMICA ≥146.35 pg/mL）、低sMICA 水平组34 例（sMICA ＜146.35 pg/mL）。Kaplan-Meier 生存曲线见图1、2。经Log rank χ2检验，高DJ-1 水平组NSCLC患者PFS 生存率、OS 生存率分别为52.78%（19/36）、58.33%（21/36），低于低DJ-1 水平组的92.68%（38/41）、95.12%（39/41）（χ2=7.346 和6.348，P=0.007 和0.012），高sMICA 水平组NSCLC 患者PFS 生存率、OS生存率分别为60.47%（26/43）、65.12%（28/43），低于低sMICA 水平组的91.18%（31/34）、94.12%（32/34）（χ2=7.433 和6.297，P=0.006 和0.012）。

图1 不同血清DJ-1水平NSCLC患者PFS、OS生存曲线图

2.4 NSCLC患者预后影响因素的Cox回归分析

以NSCLC 患者预后不良（0 =否，1 =是，t =生存期）为因变量，纳入年龄（1 ≤60 岁，2 ≥60 岁）、性别（1=女，2=男）、吸烟史（1=无，2=有）、肿瘤直径（1 ≤3 cm，2 ≥3 cm）、病理类型（1=腺癌，2=鳞癌）、分化程度（1=高度分化，2=低中度分化）、TNM 分期（1=Ⅰ、Ⅱ期，2=Ⅲ、Ⅳ期）、淋巴转移（1 =否，2 =是）、远处转移（1=否，2 =是）、sMICA（1 ≤146.35 pg/mL，2 ≥146.35 pg/mL）、DJ-1（1 ≤18.24 ng/mL，2 ≥18.24 ng/mL）为自变量，纳入多因素Cox回归模型（逐步后退法，α入=0.05，α出=0.10），结果显示：淋巴结转移（=1.697，95% CI：1.421，1.953）、分化程度（=1.344，95% CI：1.194，1.648）、DJ-1 水平（=1.831，95% CI：1.652，2.354）和sMICA 水平（=2.164，95%CI：2.012，3.956）是NSCLC 患者预后不良的影响因素（P＜0.05）。见表3。

表3 影响NSCLC患者预后的多因素Cox回归分析参数

图2 不同血清sMICA水平NSCLC患者PFS、OS生存曲线图

3 讨论

NSCLC 是最常见的肺癌类型，我国2014年新发肺癌病例78.1 万，死亡62.6 万，居男性肿瘤发病率和病死率首位，居女性肿瘤发病率第二位、病死率第一位[6]。NSCLC 早期诊断率低，确诊患者多数已处于中晚期，约50%患者生存状况较差[7]。肿瘤细胞分化程度、侵袭、迁移等恶性生物学行为是导致治疗失败、肿瘤复发、患者死亡的重要因素。识别NSCLC与临床病理特征及预后的相关机制可为临床分子靶向治疗提供新的靶点，为预后评估提供准确的信息，进而加强干预，达到改善预后目的。因此寻找预测NSCLC患者预后的非侵入性指标十分重要。

DJ-1 属丝裂原依赖性癌基因，位于染色体1p36.2-p36.3，分子量约20 kD，参与机体RNA 结合、信号转导、氧化应激、细胞凋亡、肿瘤生成过程[8]。现有研究显示DJ-1 在直肠癌[9]、甲状腺乳头状癌[10]、胶质母细胞瘤[11]等多种恶性肿瘤表达升高，且与肿瘤侵袭、转移有关。DJ-1 是否能成为NSCLC 预后预测的潜在生物学指标尚不确定，本研究发现NSCLC 组血清DJ-1 水平高于对照组，DJ-1 在低中度分化、有淋巴结转移、有远处转移患者中水平明显高于高度分化、无淋巴转移、无远处转移患者，说明DJ-1 与NSCLC 恶性程度有关，参与NSCLC 侵袭、转移过程。BAI 等[12]报告DJ-1 表达与NSCLC 淋巴转移显著相关，也验证了DJ-1 参与NSCLC 转移的过程。从Kaplan-Meier 生存曲线可以看出高水平DJ-1 患者PFS、OS 生存率偏低，Cox 回归分析高水平DJ-1 与NSCLC 预后不良有关，经进一步校正混杂因素，DJ-1仍与NSCLC 不良预后有关，提示DJ-1 水平升高可能促进NSCLC 高度侵袭和转移，导致不良预后的发生，DJ-1 可能成为NSCLC 侵袭、转移的潜在指标，为临床预后评估提供有效信息，并为NSCLC 分子靶向治疗提供新的思路和方向。DJ-1 参与NSCLC 不良预后的机制：Jun 氨基末端激酶（JNK）通过B 细胞淋巴瘤2（Bcl-2）-Beclin1 复合物介导自噬反应，抑制肿瘤细胞生长，DJ-1 通过JNK 依赖途径改变自噬，调控Beclin1 参与的自噬反应，DJ-1 过表达抑制JNK 和Bcl2 磷酸化，进而阻止Beclin1 和Bcl2 解离，促使肿瘤细胞增殖[13]。其次，DJ-1 通过张力蛋白同源的基因（PTEN）/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路参与癌细胞的增殖、迁移和侵袭，下调DJ-1 表达，肿瘤细胞G0/G1 期细胞数量增加，S 期细胞数量减少[14]。DJ-1 过表达可通过上调P-糖蛋白（P-gp）与凋亡蛋白Bcl-2 的表达，促进药物主动外泄，导致化疗耐药，增强肿瘤细胞的抗凋亡能力[15]，最终导致疾病进展和不良预后发生。

MICA 是NK 和CD8 T 淋巴细胞表面激活受体——自然杀伤细胞2 族成员D（NKG2D）的配体，由MHC 基因编码，分子量43 kD，表达于胸腺、胃肠道及肿瘤细胞表面，主要发挥免疫应答作用。当肿瘤发生时MICA 通过与NKG2D 配体特异性结合传递活化信号，诱导以NK 细胞为主的免疫应答，清除肿瘤细胞，发挥免疫监视作用[16]。sMICA 是MICA 的可溶性形式，是MICA 脱落形成的游离状态，MICA 脱落降低了MICA 水平，影响NKG2D 识别，进而诱导T 细胞表面和NK 细胞表面NKG2D 内化、降解，影响NK 细胞的免疫监测，促进肿瘤细胞免疫逃逸[17]，在肿瘤免疫效应中发挥与MICA 相反的作用。有研究显示sMICA在食管癌组织中过度表达，与TNM 分期、分化程度、化疗疗效均存在密切关系[18]，乳腺癌患者血清sMICA水平明显升高，sMICA 水平与临床分期、淋巴结转移均有关[19]。目前sMICA与NSCLC患者预后的关系尚不确定，本研究发现NSCLC患者血清sMICA水平也明显升高，sMICA水平与NSCLC患者分化程度、TNM分期、淋巴结转移有关，说明sMICA参与NSCLC侵袭、转移病理机制。生存分析和回归分析结果证实高水平sMICA与NSCLC患者预后不良有关，sMICA可以作为NSCLC预后评估的一个参考指标。sMICA参与NSCLC不良预后的机制可能为：肿瘤低氧微环境介导sMICA表达上调，通过阻断NKG2D 通路来抑制NK 细胞对肿瘤细胞杀伤性，导致肿瘤免疫逃逸，促使肿瘤增殖、侵袭及转移[20]。杨斌等[21]报道显示随着肺癌患者血清sMICA 水平升高，NKG2D+CD8+NKT 细胞含量减少，sMICA 抑制NKG2D+CD8+NKT 功能活性，sMICA、NKG2D+CD8+NKT细胞共同作用下诱导肿瘤免疫逃逸过程。以上结果提示sMICA 异常升高可能是NSCLC 肿瘤细胞逃避NKG2D 介导免疫监视的机制之一，抑制MICA 脱落可能下调sMICA水平，激活NK细胞为主的免疫效应，达到清除肿瘤细胞的目的。

综上所述，NSCLC患者血清DJ-1、sMICA水平均升高，高水平DJ-1、sMICA与NSCLC患者不良预后有密切关联。DJ-1、sMICA可能为NSCLC患者预后评估提供参考，并为NSCLC治疗提供新的靶点。