支气管哮喘患者外周血CD3+T细胞趋化因子受体表达的研究

陈旭东

（山东省立第三医院 呼吸内科，山东 济南250031）

趋化因子是由白细胞、树突状细胞、血小板等多种细胞产生，分子量较小（8～10 kD）、具有趋化活性的蛋白质。在先天、适应性免疫系统、稳态、血管生成及扩张、炎症、创伤、肿瘤转移等多种生理病理过程中，趋化因子发挥重要作用。趋化因子是具有7 次跨膜区域的G 蛋白耦联受体，位于血小板、中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞、T 细胞等细胞中。由于趋化因子受体是潜在的治疗靶点，目前趋化因子受体已被广泛研究。临床上已经开发出针对趋化因子的受体拮抗剂和单克隆抗体[1-2]。小分子CXCR2 和CCR1 拮抗剂已应用于几种炎症疾病动物模型，双抗CCR3 和抗H1-拮抗剂也被证实可缓解人类过敏性鼻炎症状[3]。

过敏是系统性疾病，其系统性行为和局部产生的介质能够刺激骨髓和淋巴器官，由此产生炎症细胞并释放至血液，炎症细胞最终从血液中募集至炎症部位[4]。支气管哮喘是嗜酸性粒细胞和Th2 细胞主导的慢性炎症疾病。此外，T 细胞毒性细胞等其他T细胞亚群在支气管哮喘中也发挥重要作用，特别是在急性哮喘发作导致死亡的时候[5]。在炎症因子刺激作用下，机体从血液中募集T 细胞及其他白细胞至支气管炎症位点并产生趋化因子。目前关于趋化因子受体的研究，均在支气管肺泡灌洗液、诱导痰或呼吸道上皮纤毛中进行[6-7]。本研究通过评估不同严重程度哮喘患者外周血CD3+CD8+和CD3+CD8-T 细胞趋化因子受体表达情况，分析不同严重程度支气管哮喘患者CD3+T细胞趋化因子受体表达的差异。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2017年1月—2017年12月山东省立第三医院就诊的40 例支气管哮喘患者。依据《支气管哮喘防治指南（2016年版）》[8]，将患者分为轻、中度支气管哮喘患者组23 例，平均年龄（36.1±8.1）岁，哮喘持续时间为（11.2±1.8）年，第1 秒用力呼气容积占用力肺活量比值（FEV1%）（91.2±7.8）%；重度支气管哮喘患者组17 例，平均年龄（32.3±9.2）岁，哮喘持续时间为（12.3±2.4）年，FEV1%（59.5±2.4）%；两组患者年龄、哮喘持续时间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。两组FEV1%差异有统计学意义（P＜0.05）。纳入同期本院体检的27 例肺功能正常的健康志愿者作为对照组，平均年龄（35.8±7.6）岁。基于每日吸入糖皮质激素（布地奈德）的剂量，将本研究纳入的23 例轻、中度哮喘患者又分为＜400 μg/g 组11 例、400～800 μg/g 组5 例和＞800 μg/g 组7 例。基于患者FEV1%预计值，将本研究纳入的40 例哮喘患者分为FEV1%预计值≤80%组12 例和FEV1%预计值＞80%组28 例。哮喘患者和健康志愿者入组采血前4 周内均未发生呼吸道感染。哮喘患者和健康志愿者年龄匹配，且均为非吸烟者。排除标准：其他全身性炎症和慢性疾病，需要全身用糖皮质激素。本研究经医院医学伦理委员会批准，患者家属知情并签署知情同意书。

分级标准：①轻度：患者步行或上楼梯时气短，可平卧，说话可连续成句，精神状态尚可；体格检查无辅助呼吸肌活动及三凹征，哮鸣音不明显，心率（HR）＜100 次/min；实验室检查氧分压正常，二氧化碳分压（PCO2）＜45 mmHg，血氧饱和度（SpO2）＞95%。②中度：患者轻微活动后即感觉气短，端坐呼吸，说话断断续续，精神状态可，偶有焦虑和烦躁；体格检查偶有辅助呼吸肌活动及三凹征，哮鸣音清晰并广泛存在，HR＜120 次/min；实验室检查氧 分 压（PO2）60～80 mmHg，PCO2≤ 45 mmHg，SpO291%～95%。③重度：患者休息时也能感觉到气短，端坐呼吸，说话只能说词语或单字，精神状态差，焦虑烦躁明显；体格检查有辅助呼吸肌活动及三凹征，哮鸣音清晰并广泛存在，HR ＞120 次/min；实验室PO2＜60 mmHg，PCO2＞45 mmHg，SpO2≤90%。

患者目前使用的药物包括短效和/或长效β-2激动剂、白三烯调节剂和吸入性糖皮质类固醇类（布地奈德每日剂量不超过1 600 μg/g）。轻、中度支气管哮喘组23 例患者中11 例日常吸入糖皮质激素（布地奈德）的剂量＜400 μg/g，5例吸入剂量400～800 μg/g，7 例吸入剂量＞800 μg/g；重度支气管哮喘组患者吸入剂量每日均超过800 μg/g。

1.2 采用流式细胞仪检测CD3+CD8+和CD3+CD8-T细胞上CXCR1、CXCR2、CXCR3、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8等趋化因子受体的表达情况

入组后次日清晨，收集所有受试者7 mL 全血，EDTA 抗凝，6 h 内完成检测。采用20 μL PerCP 标记的CD3，20 μL FITC 标记的CD8，20 μL PE 标记的CXCR1、CXCR2、CXCR3、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8 对细胞进行染色。下列采用PE 标记的同型抗体作为对照：小鼠抗人CXCR1 IgG2b、小鼠抗人CXCR2 和CCR3 IgG1、小鼠抗人CXCR3 IgG1、小鼠抗人CCR4 IgG2b、小鼠抗人CCR5 IgG2a、大鼠抗人CCR7 IgG2a、小鼠抗人CCR8 IgG2b。混合后暗室内常温孵育15 min，孵育10 min 后加入FACS 裂解溶液2 μL，然后将样品离心5 min并除去上清液。采用配备有氩激光器的BD FACSCalibur 流式细胞仪进行分析，数据采集及分析采用Cell Quest Pro软件。

1.3 肺功能的检测

采用德国耶格Master Screen PFT System 肺功能仪，所有受试者在同一技师的指导下完成肺功能检查。测试前测量并记录测试对象身高（cm）、体重（kg），受试者平静状态下采取坐位，技师给受试者夹上鼻夹，嘱其戴好肺功能过滤器咬嘴，平静呼吸2、3 次后，用最快的呼吸速度和最大的呼吸幅度做深呼吸，呼气时间至少维持5 s，每位受试者均行3 次肺功能检测，测定出FEV1%预计值的最佳值，将其进行整理并收集。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验或方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同严重程度支气管哮喘患者CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体表达情况

轻、中度支气管哮喘组、重度支气管哮喘组、对照组受试者CD3+CD8+T 细胞上CXCR1 阳性表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05），重度支气管哮喘组低于轻、中度支气管哮喘组和对照组（P＜0.05），轻、中度支气管哮喘组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。3 组受试者CD3+CD8+T 细胞上CCR7 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），重度支气管哮喘组低于对照组（P＜0.05），轻、中度支气管哮喘组分别与重度支气管哮喘组和对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。3 组受试者CD3+CD8+T 细胞上CXCR2、CXCR3、CCR3、CCR4、CCR5、CCR8 阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 3组受试者CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体阳性表达率的比较 （%，±s）

表1 3组受试者CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体阳性表达率的比较 （%，±s）

组别n CXCR1 CXCR2 CXCR3 CCR3轻、中度支气管哮喘组重度支气管哮喘组对照组F 值P 值23 17 27 9.81±4.62 4.83±2.14 9.75±5.25 41.734 0.001 2.92±1.46 2.63±0.76 2.67±1.26 0.346 0.710 27.54±4.18 26.06±6.22 25.9±9.85 0.328 0.727 6.72±1.16 7.19±2.72 7.43±2.02 0.611 0.547组别轻、中度支气管哮喘组重度支气管哮喘患者组对照组F 值P 值CCR4 8.94±1.41 8.17±1.35 8.67±1.15 1.783 0.177 CCR5 17.71±4.33 16.44±1.06 15.51±3.67 2.195 0.121 CCR7 8.78±2.98 6.52±1.59 11.66±5.45 28.917 0.001 CCR8 0.48±0.12 0.32±0.14 0.41±0.25 2.249 0.117

2.2 不同严重程度支气管哮喘患者CD3+CD8-T细胞上趋化因子受体表达情况

3 组CD3+CD8-T 细胞上CXCR1 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），重度支气管哮喘组低于轻、中度支气管哮喘组和对照组（P＜0.05），轻、中度支气管哮喘组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。3 组CD3+CD8-T 细胞上CXCR2阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），重度支气管哮喘组低于轻、中度支气管哮喘组和对照组（P＜0.05），轻、中度支气管哮喘组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。3 组CD3+CD8-T细胞上CCR8 阳性表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），重度支气管哮喘组低于轻、中度支气管哮喘组和对照组（P＜0.05），轻、中度支气管哮喘组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。3 组CD3+CD8-T 细胞上CXCR3、CCR3、CCR4、CCR5 及CCR7 阳性表达率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 3组受试者CD3+CD8-T细胞上趋化因子受体阳性表达率的比较 （%，±s）

表2 3组受试者CD3+CD8-T细胞上趋化因子受体阳性表达率的比较 （%，±s）

组别n CXCR1 CXCR2 CXCR3 CCR3轻、中度支气管哮喘组重度支气管哮喘组对照组F 值P 值23 17 27 35.87±7.19 12.2±3.61 36.5±7.92 92.582 0.001 1.34±0.67 0.39±0.13 1.76±0.71 30.484 0.001 27.93±5.25 26.3±2.46 28.07±5.23 0.949 0.393 25.66±5.24 25.15±3.72 27.99±6.71 2.777 0.071组别轻、中度支气管哮喘组重度支气管哮喘组对照组F 值P 值CCR4 36.61±6.82 34.16±3.99 35.6±9.63 0.598 0.556 CCR5 42.02±5.92 41.31±6.91 39.04±5.33 2.629 0.082 CCR7 37.59±12.8 38.91±7.94 40.3±3.74 2.981 0.066 CCR8 0.41±0.25 0.13±0.07 0.32±0.17 21.482 0.001

2.3 不同剂量患者CD3+CD8+和CD3+CD8-T 细胞上趋化因子受体阳性表达率比较

3 组不同剂量患者CD3+CD8+T 细胞上CXCR1 阳性表达率比较，差异有统计学意义（F=49.410，P=0.001），每天吸入布地奈德剂量＞800 μg/g 组低于400～800 μg/g 组和＜400 μg/g 组（P＜0.05），400～800 μg/g 组低于＜400 μg/g 组（P＜0.05）。3 组不同剂量患者CD3+CD8-T 细胞上CXCR1 阳性表达率比较，差异有统计学意义（F=99.620，P=0.001），每天吸入布地奈德剂量＞800 μg/g 组低于吸入剂量400～800 μg/g 组和＜400 μg/g 组（P＜0.05），400～800 μg/g 组低于＜400 μg/g 组（P＜0.05）。见表3、4。

表3 不同剂量患者CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体阳性表达率的比较 （%，±s）

表3 不同剂量患者CD3+CD8+T细胞上趋化因子受体阳性表达率的比较 （%，±s）

组别n CXCR1 CXCR2 CXCR3 CCR3＞800 μg/g 组400～800 μg/g 组＜400 μg/g 组F 值P 值7 5 1 1 5.34±2.28 8.19±4.16 11.65±5.31 13.824 0.007 2.76±1.67 2.87±1.75 2.95±1.88 1.718 0.374 25.67±6.54 26.43±7.08 26.34±6.96 0.894 0.381 5.77±2.05 6.14±1.97 6.43±2.24 0.927 0.408

2.4 患者肺功能与CD3+CD8-T细胞上趋化因子受体的关系

FEV1%预计值≤80%组和FEV1%预计值＞80%组患者CD3+CD8-T 细胞上CXCR1 阳性表达率分别为（39.27±2.63）%和（18.21±1.14）%，两组比较，差异有统计学意义（t=4.897，P=0.004），FEV1%预计值＞80%组低于FEV1%预计值≤80%组。

续表3

表4 不同剂量患者CD3+CD8-T细胞上趋化因子受体阳性表达率的比较 （%，±s）

表4 不同剂量患者CD3+CD8-T细胞上趋化因子受体阳性表达率的比较 （%，±s）

组别n CXCR1 CXCR2 CXCR3 CCR3＞800 μg/g 组400～800 μg/g 组＜400 μg/g 组F 值P 值7 5 1 1 16.6±3.11 27.69±7.15 42.22±6.28 99.623 0.001 0.81±0.27 0.94±0.29 0.86±0.17 1.394 0.257 25.92±3.17 28.17±6.39 31.74±6.97 2.475 0.189 17.23±4.52 34.53±3.37 26.08±3.42 1.286 0.298组别＞800 μg/g 组400～800 μg/g 组＜400 μg/g 组F 值P 值CXCR4 38.22±4.16 34.68±8.36 38.87±5.86 2.117 0.267 CXCR5 39.36±5.65 44.85±4.55 43.42±5.37 0.988 0.472 CXCR7 32.45±6.29 38.39±3.82 41.52±3.33 1.869 0.288 CCR8 0.16±0.08 0.39±0.26 0.57±0.06 1.999 0.274

3 讨论

本研究评估CD3+CD8+和CD3+CD8-T 细胞上趋化因子受体CXCR1、CXCR2、CCR3、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR8 的表达情况，结果发现：重度支气管哮喘组CD3+CD8+T 细胞上CXCR1 和CCR7 阳性表达率低于对照组，重度支气管哮喘组CD3+CD8+T细胞上CXCR1 阳性表达率低于轻、中度支气管哮喘组。此外，本研究还发现重度支气管哮喘组CD3+CD8-T 细胞上CXCR1、CXCR2 和CCR8 阳性表达率低于轻、中度支气管哮喘组和对照组。轻、中度支气管哮喘组与对照组CD3+CD8+和CD3+CD8-T 细胞上所有趋化因子受体的阳性表达率差异均无统计学意义。与预期不一致的是，本研究发现，对照组和轻、中度支气管哮喘组CD3+CD8-T 细胞上CXCR1、CXCR2 和CCR8 阳性表达率低于重度支气管哮喘组。

CXCR1 和CXCR2 主要在单核细胞/巨噬细胞、肥大细胞、平滑肌细胞和T 细胞中表达，能够结合CXCL1/GROα、 CXCL2/GROβ、 CXCL3/GROγCCL5/ENA-78、CXCR6/GFP-2，CXCR7/NAP-2，CXCL8/IL-8等趋化因子[9]。本研究发现，重度支气管哮喘组CD3+CD8+和CD3+CD8-T 细胞上CXCR1 阳性表达率低于轻、中度支气管组和对照组。重度支气管哮喘组CD3+CD8-T 细胞上CXCR2 阳性表达率低于轻、中度支气管组和对照组。CXCR1 和CXCR2 主要功能是趋化和激活嗜中性粒细胞，但研究证实单核细胞、巨噬细胞、T 细胞、树突状细胞和平滑肌细胞中也具有类似功能[10]。重度支气管哮喘患者外周血中至少有一种T 细胞上CXCR1 和CXCR 阳性表达率下降，提示趋化因子与T 细胞表面相应受体的结合能力下降，导致整合素CD11b 表达及其与内皮细胞黏附能力受损。因此，重度支气管哮喘患者T 细胞由血液循环迁移至气道组织过程被削弱[11]。研究发现，重度支气管哮喘患者上皮下膜中CXCR1 和CXCR2 mRNA 表达高于对照组，由于上皮下膜中中性粒细胞和嗜酸性粒细胞含量高[12]，因此，该结果与本研究结果一致。

此外，CXCR1 和CXCR2 在慢性阻塞性肺疾病患者肺部残留的上皮细胞和平滑肌细胞中也有一定的表达，这些残留细胞能够通过趋化因子信号适应炎症引起的微环境变化[14]。因此，外周血T 细胞表面趋化因子表达变化还可能与肺组织改变有关。

本研究发现，重度支气管哮喘患者CD3+CD8+和CD3+CD8-T 细胞上CCR7 阳性表达率低于对照组。CCR7 是CCL19/MIP-3β 和CCL21/SLC 的受体，CCL19/MIP-3β 和CCL21/SLC 及其受体介导T 细胞归巢至二级淋巴器官[14]。小鼠效应T 细胞提呈CCR7 后，能够引导T细胞从肺迁移至淋巴管[15]。有研究发现，CCR7在哮喘患者气道平滑肌中表达[16]。因此，在重症支气管哮喘患者中，由于CCR7 表达下降，CD3+CD8+和CD3+CD8-T 细胞从肺部迁移至外周淋巴器官的能力减弱。

为评估吸入糖皮质激素对研究结果的影响，本研究又根据吸入糖皮质激素剂量对患者进行分层，比较使用不同剂量的哮喘患者间趋化因子受体的表达差异。结果发现最高剂量糖皮质激素使用患者（＞800 μg/g 的布地奈德）CD3+CD8+和CD3+CD8-T 细胞上仅CXCR1 阳性表达率低于最低剂量组患者，因此，糖皮质激素治疗仅影响CXCR1 表达。有研究表明布地奈德能够上调健康者嗜中性粒细胞CXCR1 和CXCR2 的表达[17]。已有研究表明，注射22 mg 氢化可的松并不影响CD3+T 细胞上CCR7 的表达[18]，因此，本组患者吸入糖皮质激素并不影响CCR7 表达。还有研究发现连续2 周每天使用20 mg 泼尼松导致CD4+和CD8+T 细胞上CXCR3 表达降低[19]。本组患者尽管使用吸入糖皮质激素，但3 组患者两种T细胞上CXCR3 表达无差异。

本研究还评估与Th1/Th2 应答有关的趋化因子受体，即CCR4，CCR8（Th2 应答）和CCR5 和CXCR3（Th1 反应）在T 细胞上的表达情况，结果发现重度支气管组CD3+CD8-T 细胞上CCR8 阳性表达率低于对照和轻中度支气管哮喘组。CCR8 主要表达于激活的Th2 细胞[20]。ZINGONI 等[21]发现过敏支气管哮喘患者支气管活检标本T 细胞中CCR4 和CCR8 呈阳性表达，与本研究结果一致。本研究还发现，轻中度哮喘患者中CD3+CD8-T 细胞上CXCR3、CCR4、CCR5 阳性表达率高于对照组与重度哮喘组。

综上所述，本研究结果表明重度支气管哮喘患者外周血两种CD3+T 细胞上部分趋化因子受体表达减少，轻、中度哮喘患者中Th1和Th2相关的趋化因子受体参与免疫应答，而重度支气管哮喘患者Th1/Th2 应答衰减。