关于实验动物运动模型建立的伦理思考*

肖楚兰 陈娇娇 郭冰洁 殷子斐 常运立 李 柏

在历年的研究过程中，不管是众多的前瞻性研究还是动物实验研究，强有力的科学证据表明：运动已经作为一种非侵入性和非药理学的疾病防治方式在心血管、神经、内分泌等多种系统疾病的防治中发挥着积极作用[1]。

一个完整的运动实验包含实验动物的种属选取、运动模式的选择，以及运动方式、运动频率、运动强度、持续时长等运动元素的确定等多个环节。这整个过程中存在着一系列的伦理问题值得我们去探讨，只有对实验动物充分进行伦理关怀，以及对其福利进行充分地思考与落实，使其各项生理指标达到最佳状态，才能得到可信服的实验结果[2]。研究人员也不会因自己不能很好地减少实验动物的痛苦而感到过多的愧疚与不安[3]。目前，已有部分国内外学者对化学诱导的肠道炎症动物模型[4]、兔VX2肝癌模型[5]、显微外科血管插管模型[6]、大脑损伤模型[7]、骨骼肌肉系统[8]等动物模型进行了伦理分析，然而没有关于运动模型伦理思考方面的研究报道。笔者将结合自己既往的科研经验，就实验动物运动模型建立过程中应该注意的伦理关怀以及动物福利等问题展开论述，以促进研究人员更多地关注实验动物福利，并将其运用于动物运动模型的建立过程中。

1 实验动物伦理

实验动物伦理概念的提出是出于对实验动物人道主义的关注，以生命伦理准则来规范动物实验，使人类能够遵循相关伦理制度，减少动物实验对动物所造成的伤害[9-10]。目前，实验动物伦理广为应用的两大基本准则有3R原则以及5F原则。两者切入点不同却又相互补充，相辅相成，使实验动物伦理更为全面和科学，而且将动物福利的实现达到最优化。

3R原则是针对动物实验而提出的实验原则：(1)减少(reduction)；(2)替代(replacement)；(3)优化(refinement)[11]。3R原则主要聚焦于从根源上减少动物实验的伦理问题，包括实验前动物的选择以及减少实验的动物数量。而5F原则是旨在提高动物福利的一项基本原则，即减少动物(尤其是受人类控制的)不必要的痛苦，广泛应用于各个领域，也包括动物实验：(1)免受饥饿的自由(freedom from hunger and thirst)；(2)生活舒适的自由(freedom from discomfort)；(3)免受痛苦的自由(freedom from pain,injury and disease)；(4)免受焦虑的自由(freedom from fear and distress)；(5)表达天性的自由(freedom to express normal behavior)。5F原则的应用更加倾向于实验动物生存环境的改善与实验进程中的操作方法优化[9]。

2 运动方案基本要素

一个完整的运动方案包括运动方式、运动强度、运动频率、持续时长。一般而言，实验动物的运动方式主要包括跑步机跑步、游泳、负重爬梯、自愿轮跑以及挖洞[12-15]，其他还有电刺激蹲跳、电刺激仰卧起坐[16-17]等不常用的运动方式。根据运动能量代谢的不同可以分为有氧运动和无氧运动[18]。而从实验动物伦理角度而言，根据实验动物本性是否愿意参与这项运动，可以将运动方式归类为强迫与自愿的运动模式[19]，这值得我们深入剖析与思考。

自愿运动主要包括自愿轮跑和挖洞，研究人员只需提供可记圈的跑轮或挖洞条件，动物会基于本能而产生运动行为。而强迫运动需要外界的刺激而进行运动，主要包括跑步机跑步、游泳、负重爬梯，其他不常见的还有电刺激蹲跳等。除了运动方式之外，运动强度是强迫运动特征性要素，跑步机跑步主要通过调整速度、时长和坡度；游泳通过改变时长和负重；负重爬梯则是调整爬梯角度、梯距和次数。运动频率和持续时长在各种强迫运动方式之间基本无差别(运动频率以每周5天～7天为主；持续时长≤6周为短期运动，>6周为长期运动)[1]。而自愿运动不用考虑运动强度和运动频率，持续时长则同强迫运动。

此外，运动方案还可细分为三个阶段：适应阶段、训练阶段、恢复阶段。适应阶段是实验动物在进行任何运动形式的训练计划之前都需要进行的训练阶段，在这一阶段研究人员应给予1周～2周时间让实验动物循序渐进地去适应它们的运动环境。之后训练阶段则按照制定的训练计划进行实施。恢复阶段则包括实验动物运动训练之外的所有时间[1]。 动物伦理与实验动物运动模型建立的概览图，见图1。

图1 动物伦理与实验动物运动模型建立

3 实验动物运动模型相关伦理分析

3.1 运动训练前的伦理

3.1.1 动物种属

在运动训练前实验动物的选择中，主要遵循3R的减少和替代原则[20]。对于运动实验而言，它涉及到医学各个领域，包括心血管系统、神经系统、消化系统、呼吸系统等[21-23]。运动实验动物也包括常见的鼠、兔、犬、猪，甚至是猴，所以这就要求我们在实验动物选择中尽量以低等生物代替高等生物，预实验中更是应当以低等生物为主[24]。就目前而言，运动动物模型造模一般选取鼠类，因为鼠类实验动物往往能满足大部分实验的需要。此外，鼠类实验动物相较于其他高等实验动物更为经济。但是，由于某些特别需求，更为高等的实验动物也会被应用于运动实验。例如，运动对于心血管系统的影响是目前运动实验的热点之一。由于猪与人类的心脏在大小、结构、工作原理上基本一样，许多人员在研究运动对于心血管系统的影响时也会选择猪作为实验对象。Zheng等[25]在研究运动对冠状动脉循环中的肌球蛋白磷酸酶的影响时便选择了猪为实验对象，此外，他们还在猪的左回旋支动脉周围放置了Ameroid收缩器，小型实验动物将很难满足这一点需求。

3.1.2 运动模式

对于运动模式的选择而言，一般性干预条件如给药、种植皮下瘤等在不影响实验动物运动水平的前提下并不会影响运动模式的选择。然而，当我们将目光聚焦到动物本身的意愿时，其中有许多问题值得我们深入探讨。可以说自愿模式是一种体育活动模式，是实验动物出于新陈代谢需要或是出于运动本能的一种自愿行为。例如，Roemers等[12]根据鼠类挖洞的生活本能提供运动组小鼠食物颗粒、木屑或密度更高的材料的穴居条件，通过小鼠从洞穴中取出的基质量来量化动物所做的工作量。除此之外，自愿轮跑是提供运动组小鼠一个可记圈数跑轮来量化小鼠的运动量。相对于自愿模式，强迫模式更像是一种运动训练模式，即有组织和有目的的体育活动，是研究人员根据自己的需求而强加在动物身上的一种训练方式[26]。实验动物每周甚至是每天在固定的时间需要完成固定的运动量，而这不是出于实验动物本身的选择。

从5F原则中免受痛苦、免受焦虑、表达天性三个角度而言，自愿性运动(如自愿轮跑、挖洞)相较于强迫性运动(如跑步机跑步、游泳)给实验动物带来更多的是天性的表达，而不是痛苦和焦虑，更不是求生欲所驱使下的运动。动物本能运动行为即自愿性运动，相较于强迫性运动，更加符合动物伦理关怀与动物福利的要求。此外，从实验角度而言，有研究分别检测记录了人类自愿性体力活动和强迫性运动训练前后的血清皮质酮和粪便皮质酮代谢物含量变化，结果发现自愿性体力活动所诱导的含量变化显著低于强迫性运动训练。而这两项指标与动物压力应激因素息息相关，这将会影响到实验本身的可信度[26]。所以两种运动模式所引起的其他应激或者生理变化也应当纳入运动方案设计的研究之中。 另外一点值得思考的是，在强迫性运动中，研究人员可以通过改变运动参数来精准控制实验动物的运动强度从而探索不同强度的运动对于实验动物的影响。例如，Xie等[27]将雌性C57BL/6脑脊髓炎小鼠的中强度游泳运动干预建模方案设置为：小鼠每天游泳50分钟，0%体重负荷，5天/周，6周以上。而高强度组采用4%体重负荷以改变运动强度。自愿性运动的运动强度只能通过仪器测得的数据来测算实验动物的运动量，不能够有效地控制运动强度和持续时长。

自愿运动相较于强迫运动更加符合5F原则，强迫运动也有其不可或缺的优势。研究人员应当在自愿运动与强迫运动之间探索一种折中的运动模式，同时满足研究人员的实验需求以及实验动物的伦理需求。而目前在进行强迫运动实验时则更加应当关注运动干预过程中对实验动物的伦理关怀。

3.1.3 运动剂量

对于运动剂量问题而言，其中最突出的问题便是运动强度的判定，目前对于实验动物最大运动强度的判定方法至今并未达到一个共识。尽管目前以锚定比例测量，如最大摄氧量、峰值摄氧量、最大心率和最大工作效率为主要测量方法。其他包括通气阈、气体交换阈、呼吸补偿点、最大乳酸稳态等也被尝试应用于运动强度的界定中[28]。动物运动实验缺少一个统一标准来规范运动强度的判定。出于无统一标准，缺少设备、减少实验损耗等原因，部分研究人员选择直接参考文献来决定自己研究的运动强度，许多论文中甚至没有提及实验动物的运动强度的测定方式。这也将导致一个极其混乱的研究局面。

首先，不同实验中实验动物的疾病造模在一定程度上也会影响到其运动能力。例如，在其他运动元素大致相同的情况下，Yi等[29]将C57BL/6J高脂饮食肥胖小鼠的中强度游泳运动强度设置为每次游泳20分钟，而Xie等[27]的C57BL/6脑脊髓炎小鼠中强度游泳运动强度为每次游泳50分钟，肥胖小鼠的运动能力显然远不及脑脊髓炎小鼠。盲目的以种属为分类来参考运动强度将会使整个实验产生巨大偏差。即使是相同种属的相同疾病模型也会因为批次等其他因素的不同而产生较大误差。这将会导致不规范、超剂量或不符合现实的高强度运动被应用于运动动物实验，进而对实验动物带来过多的负担而造成潜在或显性伤害，甚至会造成实验动物发生死亡的情况。所以研究人员都应当采取一个共同的测量方式对其实验动物进行预测试从而确定运动强度，而不是仅仅参考文献资料而给自己的实验动物确定相同的运动强度。

其次，从测量方式上来讲，气体相关测量方式是通过呼吸气体测试仪、固定跑台、功率自行车、台阶、手摇功率计等来测量，该方式可以不断重复使用，但是设备条件将限制部分实验室的使用[30]。而最大乳酸稳态测量方式需要对实验动物进行采血来测定血液乳酸含量[31]，虽然简单易操作，但是重复使用会对实验动物造成一定伤害。

3.2 运动训练中的伦理思考

3.2.1 适应阶段

在适应阶段过程中，实验动物需要习得如何在诸如声音、灯光和电子冲击等物理刺激的作用下，在某种形式的运动中调整自己的行为。一般而言，实验动物在初次接触游泳、跑步机跑步等强迫性运动形式时会有很强烈的应激反应。而适应阶段能够很好地将实验动物置于一种较为舒适的训练环境中，并且在适应的前提下慢慢地减轻实验动物在进行运动实验所产生的一系列应激反应，包括痛苦、焦虑等负面情绪的产生，为后期实验动物完成正式实验计划打下坚实的基础，这也更符合动物福利以及动物伦理的要求。在这一阶段结束时，实验动物也应当已经能够适应相应环境并按照实验计划完成相应的运动方案。例如，Chan等[32]为了让实验小鼠能够完成10米/分钟，持续60分钟的跑步机跑步运动强度，他们在小鼠的适应阶段，让运动组最开始以6米/分钟的可接受速度适应训练方案，并在适应期逐步提高到10米/分钟,运动时间逐步延长至15分钟/天，直到运动时间能够达到60分钟/天，运动强度的渐进式提升使小鼠逐步适应了60分钟/天的运动强度。

3.2.2 训练阶段

训练阶段往往需要我们从细节上更加去关注动物福利，主要遵循优化原则，尽量将实验过程中的操作细节化，将实验动物的痛苦体验降到最小。由于自愿性运动是实验动物根据本能而进行的运动方式，所以此处笔者以常用的强迫性运动为例展开介绍。

3.2.2.1 游泳

在水池中，实验动物原始的求生欲会促使其保持游泳状态，不需要其他外力刺激强迫其进行运动，见图2A。为了提高实验动物在游泳过程中的舒适度，实验动物的游泳水温需要保持在一定的温度(30℃左右)。待实验动物游泳结束后应立即用抹布将其擦干，并以轻抚等动作来使其安定，减少其痛苦焦虑的情绪，这样可以减少实验动物在实验过程中出现意外情况，也是对实验动物福利的一种体现。与此同时，当强迫式游泳运动涉及到中高强度或者高强度时，研究人员需时刻观察实验动物的运动状态。在Netto等[33]的雌性成年Wistar妊娠大鼠游泳实验中，他们让大鼠在怀孕第7天～第20天进行游泳，每天30分钟，低强度运动组1%体重负荷，中强度运动组4%体重负荷，高强度运动组7%体重负荷。7%体重负荷如果超出了当天大鼠的可承受范围，大鼠可能会出现沉底、连续“冒泡”和游泳动作明显变形等情况。这时候需要及时确认大鼠是否已达到力竭状态并及时捞出，避免“呛咳”甚至“溺亡”的情况发生。如果动物发生呛咳而导致其不能进行下一步实验时，根据实验动物的痛苦程度，研究人员需决定是否提前处死实验动物以减轻其所受的痛苦。

3.2.2.2 跑步机跑步

由于游泳运动的特殊性，实验动物可能不得不游至“力竭”状态以寻求生机。而不同于游泳运动，跑步机运动(见图2B)中更多存在的是实验动物配合度不够的情况。这是因为跑步机运动本来就属于强迫性运动范式，当跑步机速度或坡度超出了实验动物的舒适范围，它们可能会因为自己的主观意愿而出现配合度不够的情况，即跑步减速或是直接停留在跑带上。这种情况不仅仅会出现在高强度的跑步运动中，低强度、中等强度同样也会出现不愿意奔跑的情况。这时候就需要一些外源刺激促使它们继续奔跑。Kang 等[34]对他们的低、高强度组的雄性C57Bl/6衰老小鼠就会采取轻戳后腿或者轻微电击刺激来迫使其继续完成实验要求，该刺激也不能过大从而导致实验动物强烈的应激状态发生。但是，如果外源刺激也不能促使实验动物完成训练计划，那么该运动强度可能已经远超了实验动物可承受范围，建议更改实验计划。

此外，相较于游泳运动所导致的“呛咳”和“溺水”，跑步机运动对研究人员的注意力要求更高。因为实验动物造成的伤害往往更为迅速，这里并不是指死亡，而是实验动物很有可能会在跑步机的夹缝中受伤，并因此不能完整结束实验计划甚至发生死亡的情况，这也可能是实验动物本身并没有意识到的危险因素。此时实验动物的处死是很必要的，这也将大大地增加实验动物的用量以及痛苦程度。

3.2.2.3 负重爬梯

负重爬梯(见图2C)在实验过程中需要不断地对实验方案进行调整以便实验动物能够完整地完成运动方案。同跑步机跑步一样，实验动物很容易出现倦怠的情况，并影响实验的进程，需要研究人员进行反复的刺激以迫使实验动物完成方案，研究人员施加的刺激应当相对轻柔，只要能够驱使实验动物进行攀爬就已经足够。同时，负重爬梯实验的后期负重往往会逐步增加到体重的75%、90%，甚至是100%[35]，研究人员应当细心地观察实验动物的爬梯状况，以免其在实验进程中跌落受伤而不能完成后续训练计划。虽然很难出现直接死亡的情况，但出于免除痛苦的原因，研究人员也应当处死受伤的实验动物，这样也会增加实验动物的用量。

3.2.3 恢复阶段

该阶段研究人员应当关注实验动物的身体状态，及时发现实验动物可能因为运动而出现的生理不适或者是疾病等状况。在此阶段，实验动物也应当被提供很好的生活环境，包括足够的空间、食物等，以便其很好地恢复从而进行下一轮运动训练。

图2 强迫性运动图例及注意事项

3.3 实验动物的处死取材

运动动物模型的处死取材与其他实验动物模型一致，一般采取吸入二氧化碳、静脉或腹腔注射过量巴比妥类药物、过量麻醉、麻醉后放血等方法，让实验动物在无痛苦的环境中终止生命[5]。同时，在实施安乐死时不应该让其他实验动物看到，以免其他实验动物产生恐惧心理[36]。待所有实验动物安乐死后，应当将其尸体包裹并置于冰柜内暂时保存，之后进行无害化处理，这不仅是生物安全的必须要求，也是人类对实验动物为人类健康事业贡献出生命的一种感激的表现以及对实验动物伦理关怀的体现，这也能在一定程度上减轻研究人员对于处死实验动物而感到的不安，甚至是伦理上的困惑[37]。

4 结语

运动作为一种有效的非药物疗法，其有效性已经在多个系统疾病中得到证实，潜在研究价值巨大。尤其是运动疗法的多靶点性使得其在疾病的防治过程中较传统治疗方式有着特殊的优势。然而，实验动物运动干预的过程中涉及到的诸多伦理问题也应当引起研究人员的高度重视。对于生物或医疗领域的工作人员而言，对实验动物进行伦理关怀是其高尚人文精神的体现，也是实验动物的福音所在。