免疫组化双重染色技术在非小细胞肺癌PD-L1检测中的应用

徐 瑶，王满香，王明伟，张杨鸽龄，金 苏，方 娜，岳君秋

位居恶性肿瘤的第2位(11.4%)，并且是癌症死亡的主要原因(18%)[1]。针对PD-1/PD-L1的多种抑制剂已获美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)及我国国家药品监督管理局(National Medical Products Administration, NMPA)批准，用于非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)的免疫治疗。其中Pembrolizumab成为PD-L1高表达患者的一线治疗用药，低表达患者可采用免疫联合化疗，因此PD-L1表达水平对指导NSCLC的治疗决策具有重要意义[2-4]。由于PD-L1不仅表达于肿瘤细胞，还表达于免疫细胞、坏死细胞甚至正常细胞，给准确评估肿瘤比例评分(tumor proportion score, TPS)造成困难。因此，本实验拟建立PD-L1/TTF-1或PD-L1/p40免疫组化双重染色技术，以准确评估肺腺癌和鳞状细胞癌细胞中PD-L1的表达水平，更好地为临床治疗决策提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料收集2018～2020年湖北省肿瘤医院病理科诊断的NSCLC样本：肺腺癌25例(活检12例，手术切除13例)，肺鳞状细胞癌25例(活检5例，手术切除20例)。其中22例(14例腺癌和8例鳞状细胞癌)既往已行PD-L1检测，设为检验双重染色可行性及优化实验条件的阳性对照病例。排除标准：肿瘤细胞数<100个；TTF-1、p40阴性或非均质性表达的腺癌/鳞状细胞癌病例。

1.2 主要试剂及仪器TTF-1(兔单抗EPR-5955，稀释比1 ∶300，Abcam公司)，p40(兔多抗ZA-0483，稀释比1 ∶300，北京中杉金桥公司)，PD-L1(鼠单抗22C3，稀释比1 ∶50，Dako公司)，DAB快红双重染色检测试剂盒(DS0003，含酶标羊抗兔二抗，北京中杉金桥公司)、酶标羊抗鼠二抗(IB000087，北京中杉金桥公司)。对照组PD-L1单染采用获批的PD-L1伴随诊断试剂盒(同上)，染色平台为Dako Link 48全自动免疫组化染色仪，染色流程严格按试剂盒说明书进行。

1.3 方法标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，3 μm厚切片，行HE染色及免疫组化双重染色。免疫组化双重染色流程：(1)全自动免疫组化预处理仪(PT-Link，Dako公司)修复；(2)加入第一种一抗PD-L1，37 ℃孵育1 h；加入Linker，37 ℃ 30 min；加入相应二抗，37 ℃孵育30 min，DAB显色4 min，拍照；50 ℃水浴阻断1 h，加入第二种一抗TTF-1或p40，37 ℃孵育1 h，加入相应二抗，37 ℃孵育30 min，快红显色5 min；(3)苏木精复染，氨水返蓝，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明、封固。

1.4 结果判读PD-L1结果判读由资深病理医师在双盲法下完成阅片及判读。在同一张免疫组化切片中，结合TTF-1或p40定位于癌细胞，准确评估肿瘤细胞PD-L1的TPS，将PD-L1表达水平分为无表达(TPS<1%)、低表达(1%≤TPS<50%)和高表达(TPS≥50%)。

1.5 统计学分析采用SPSS 26.0统计学软件进行两配对样本的非参数检验，即Wilcoxon符号秩检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-L1和TTF-1、p40免疫组化双重染色定位免疫组化双重染色显示：PD-L1呈棕黄色(任何强度、部分或完整的细胞膜线状或颗粒状着色)，表达于肿瘤细胞、免疫细胞及正常上皮细胞胞膜；TTF-1呈红色或紫红色，定位于肺腺癌细胞(图1)和正常肺泡上皮细胞胞核；p40呈红色或紫红色，定位于鳞状细胞癌细胞和正常支气管黏膜基底细胞胞核(图2)。各指标定位准确，易于判读。

图1 腺癌PD-L1/TTF-1免疫组化双重染色显示：PD-L1呈细胞膜阳性，TTF-1表达定位于细胞核 图2 鳞状细胞癌PD-L1/p40免疫组化双重染色显示：PD-L1呈细胞膜阳性及颗粒状着色，p40表达定位于细胞核 图3 腺癌，PD-L1阳性细胞包括肿瘤细胞(TTF-1阳性)和免疫细胞(TTF-1阴性)，免疫组化PD-L1/TTF-1双重染色 图4 鳞状细胞癌，PD-L1阳性细胞均为免疫细胞(p40阴性)，癌细胞(p40阳性)PD-L1阴性，免疫组化PD-L1/p40双重染色 图5 鳞状细胞癌：原发灶部分区域癌细胞PD-L1阴性，免疫组化PD-L1/p40双重染色 图6 鳞状细胞癌：同一病灶部分区域癌细胞PD-L1呈强阳性，免疫组化PD-L1/p40双重染色

2.2 免疫组化双重染色区分肿瘤细胞与非肿瘤细胞的PD-L1染色通过TTF-1和p40表达分别定位腺癌细胞和鳞状细胞癌细胞，可将TTF-1或p40阴性、PD-L1阳性的免疫细胞剔除，不计入TPS(图3、4)。

2.3 免疫组化双重染色与PD-L1单染对比分析既往已行PD-L1单染的22例NSCLC经免疫组化双重染色后，19例双重染色结果与单染结果在相同表达区间，3例与单染结果不符合(表1)。3例不符合病例中，2例腺癌均为小标本，免疫组化双重染色切片肿瘤细胞数量比单染切片的肿瘤细胞数量明显减少；1例鳞状细胞癌为手术切除标本(原发灶)，与既往行单染的活检标本部位(转移灶)不同，本实验将该病例手术切除的原发灶及胸壁转移灶所有肿瘤组织蜡块均进行了免疫组化双重染色，结果显示原发灶TPS从<1%到高达65%(图5、6)，转移灶为5%～25%，呈明确的异质性表达。

统计分析，22例NSCLC中14例肺腺癌和8例肺鳞状细胞癌PD-L1免疫组化单染和双重染色的TPS结果差异均无统计学意义(P=0.112，P=0.357)。因此，PD-L1免疫组化双重染色方法具有可行性，结果可靠。

2.4 免疫组化双重染色结果的一致性分析三名病理医师对所有免疫组化双重染色病例分别进行盲评，结果分布区间一致，TPS数值范围为0～10%(均未影响PD-L1表达水平分区，表1)。而在实际工作中，如肿瘤内部混杂有免疫细胞时，可能因难以区分阳性细胞为肿瘤细胞或免疫细胞，导致不同病理医师对单染PD-L1的结果判读差异较大，甚至差异可能超过20%(部分位于阈值附近的病例可能影响分区)。借助TTF-1和p40的表达定位于癌细胞，剔除免疫组化单染中不易分辨的PD-L1阳性免疫细胞后，判读者之间的判读一致性较单染者高。

表1 免疫组化双重染色与PD-L1单染TPS对比分析

3 讨论

PD-L1可表达于肿瘤细胞和免疫细胞、坏死细胞，在肿瘤细胞与免疫细胞混杂的病例中，免疫组化单染评估TPS存在偏差。PD-L1/TTF-1或PD-L1/p40免疫组化双重染色技术所用的两种抗体种属、定位和显色均不同，可避免非特异性着色可能性；并且TTF-1和p40不表达于免疫细胞胞核，可有效区分肿瘤细胞与免疫细胞，可剔除PD-L1阳性的非肿瘤细胞，从而提高判读者之间的判读一致性。邢杰等[5]的实验结果亦证实在评估肿瘤细胞PD-L1的表达时，免疫组化双重染色比单染具有明显的优势。

本实验在对既往已行PD-L1检测的NSCLC病例进行免疫组化双重染色后，有3例双重染色结果与单染结果差异较大，其中2例是活检标本，肿瘤细胞数量不足，另1例的原发灶及转移灶之间，以及肿瘤内部不同区域均存在PD-L1异质性表达，其他研究亦发现这种时间及空间上的异质性，以及抗肿瘤治疗前后PD-L1表达水平出现不同程度的变化[6-7]。因此，PD-L1在肿瘤细胞中表达水平的时空异质性可能是导致部分患者治疗获益有限的原因之一，可能影响PD-L1作为生物标志物的预测价值。

综上所述，PD-L1/TTF-1和PD-L1/p40免疫组化双重染色可剔除非肿瘤细胞的PD-L1非特异性着色，提高判读者的判读一致性，有利于准确评估NSCLC中PD-L1的真实表达状态，为筛选适用于免疫治疗的NSCLC患者及预后评估提供重要参考。