维吾尔族乳腺癌中STAT3的表达及临床病理意义

周 梅，阿迪拉·斯依提，叶 明，岳 娜，陈钰伟，禤瑞霞

乳腺癌是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤之一[1]，也是女性癌症死亡的主要原因[2]。维吾尔族和汉族占新疆人口的绝大多数，维吾尔族在遗传背景、生活方式等方面不同于其他民族，因此探寻其发生发展机制，对个体化治疗以及提高维吾尔族乳腺癌患者的预后和生存质量有重要意义。信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)是一种重要的细胞质信号因子和细胞核转录因子，可与酪氨酸磷酸化通道相偶联而被激活，介导多种信号分子调控肿瘤细胞的增殖及凋亡，影响肿瘤进展[3]。STAT3在多数恶性肿瘤中被激活[4]，而其在维吾尔族乳腺癌中的作用尚未见报道。本文着重分析不同分子分型维吾尔族浸润性乳腺癌中STAT3的表达，探讨其与临床病理特征及预后的关系，为预测临床疗效提供新思路。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2013年1月～2014年12月新疆医科大学附属肿瘤医院病理科存档的维吾尔族乳腺癌80例和正常乳腺组织30例，患者均为女性，中位年龄54岁(27～81岁)。病理类型均为非特殊类型浸润性乳腺癌，组织学分级及分期标准参照WHO(2012)乳腺肿瘤分类。乳腺癌分子分型采用免疫组化替代分型(2013年St Gallen乳腺癌会议国际共识[4])，即LuminaI A型、Luminal B型、HER-2过表达型和三阴型乳腺癌[5]：ER阳性、PR阳性≥20%、HER-2阴性且Ki-67增殖指数<20%定义为Luminal A型；Luminal B型分2种情况，一种为ER阳性、HER-2阴性、Ki-67增殖指数≥20%或PR表达<20%，另一种为ER阳性、HER-2阳性、PR及Ki-67增殖指数任何表达水平；ER及PR阴性、HER-2阳性定义为HER-2过表达型；ER、PR及HER-2均阴性定义为三阴型。

1.2 免疫组化兔抗人STAT3、ER、PR、HER-2和Ki-67单克隆抗体购自北京中杉金桥公司，二抗免疫组化试剂盒及DAB酶底物显色剂等均购于福州迈新公司，免疫组化采用SP法，操作步骤按照说明书进行。(1)所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，敷贴于10%多聚赖氨酸预处理的载玻片上，60 ℃温箱烤片2 h；二甲苯中浸泡5 min，重复1次；(2)将切片依次经100%、95%、75%乙醇、蒸馏水中各浸泡3 min；(3)置于3%H2O2中室温孵育10 min；(4)放入盛有柠檬酸钠抗原修复液的高压锅中，高压2～3 min，自然冷却1 h，PBS洗涤3次；(5)滴加羊血清封闭30 min；(6)一抗按1 ∶100稀释，室温孵育2 h，PBS缓冲液洗涤3次；(7)滴加二抗，室温孵育1 h，PBS洗涤3次；(8)DAB显色2～3 min，清水冲洗终止反应；(9)苏木精复染1～2 min，盐酸乙醇分化1～3 s；(10)75%、95%、100%梯度乙醇脱水，二甲苯透明；(11)中性树脂封固，镜下观察。

结果判定：STAT3蛋白阳性为细胞质和胞核内出现棕黄色颗粒，阳性染色强度评分：无染色为0分，微弱染色为1分，染色清晰且细胞质或细胞核呈棕黄色为2分，细胞质与细胞核呈深棕色为3分；阳性细胞数评分：无阳性细胞为0分，阳性细胞数≤20%为1分，阳性细胞数21%～50%为2分，阳性细胞数>50%为3分；将上述两项评分相乘作为最终结果：0～2分为阴性，≥3分为阳性。

1.3 RT-PCR检测(1)提取总RNA与合成cDNA：所有标本经10%福尔马林固定和石蜡包埋后，6 μm厚切取样本8片，使用总RNA提取试剂盒(美国QIAGEN公司)提取组织总RNA，用紫外分光法测取RNA纯度，用qPCR-RT反转录试剂盒(Promega生物公司)进行反转录反应合成cDNA。将500 ng总RNA加入20 μL反应体系中，反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃延伸，获得cDNA后放入-20 ℃冰箱保存备用。(2)RT-PCR检测：采用Real-time PCR 法对STAT3 mRNA的相对表达量进行检测，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。引物序列由上海生工生物公司设计合成，以GAPDH为内参。STAT3上游引物：5′-CAGTGACCAGGC AGAAGA-3′，下游引物：5′-ACTCCATCGCTGACAA AA-3′；GAPDH上游引物：5′-TCGACCAGTCAGCCG CATCTTCTTT-3′，下游引物：5′-ACCAAATCCGTT GACTCCGACCTT-3′。PCR反应体系：SYBR 10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL，去离子水7.2 μL；在实时荧光定量PCR仪上进行反应，扩增条件为：95 ℃ 30 min预变性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；绘制溶解曲线：95 ℃15 min，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。每个样本设3个复孔，重复检测3次，取平均值。以GAPDH为内参照计算目的基因的相对表达量，计算公式：ΔΔCt=(CT实验组的基因-CT实验组管家基因)-(CT对照组目的基因-CT对照组管家基因)。

1.4 预后随访截止时间2019年12月31日，通过电话方式对患者进行调查，总生存时间为明确诊断至患者死亡或末次随访的时间，患者死于乳腺癌为终点事件，死于其他疾病、失访或至随访结束时患者仍存活为截尾事件。

2 结果

2.1 维吾尔族乳腺癌组织与正常组织中STAT3的表达差异在乳腺癌组织中，STAT3蛋白阳性细胞较多，着色深，呈强阳性(图1)；在正常乳腺组织中，STAT3蛋白呈弱阳性或阴性(图2)。STAT3蛋白在维吾尔族乳腺癌组织和正常组织中的阳性率分别为77.5%(62/80)和56.7%(17/30)，乳腺癌组织中STAT3蛋白的阳性率明显高于正常乳腺组织，差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。

图1 STAT3蛋白在乳腺癌中呈强阳性，SP法 图2 STAT3蛋白在正常乳腺组织中呈阴性，SP法

表1 乳腺癌和正常组织中STAT3蛋白的表达[n(%)]

STAT3 mRNA表达水平运用相对定量法通过2-ΔΔCt计算，观察溶解曲线及扩增曲线图(图3)，了解扩增情况。STAT3 mRNA在维吾尔族浸润性乳腺癌中的相对表达量(7.015±5.853)明显高于正常乳腺组织(4.324±2.258)，差异具有统计学意义(P=0.032，图4)。

图3 荧光定量扩增曲线图

图4 乳腺癌和正常组织中STAT3 mRNA的相对表达量

2.2 不同分子分型乳腺癌组织中STAT3蛋白的表达差异在维吾尔族乳腺癌中，STAT3蛋白在不同分子分型乳腺癌中的表达差异具有统计学意义(P=0.026)，HER-2过表达型乳腺癌中STAT3蛋白的阳性率高于其他分子分型(表2)。

表2 STAT3蛋白在不同分子分型乳腺癌组织中的表达[n(%)]

2.3 STAT3表达与维吾尔族乳腺癌临床病理特征的关系在维吾尔族乳腺癌中，STAT3蛋白表达与肿瘤直径、组织学分级、淋巴结转移、TNM分期均显著相关(P<0.05)，提示在肿瘤体积越大、组织学分级越高、有淋巴结转移、TNM分期越高的乳腺癌组织中STAT3蛋白的阳性率越高(表3)。

表3 乳腺癌中STAT3蛋白表达与临床病理特征的关系[n(%)]

在维吾尔族乳腺癌中，STAT3蛋白在有淋巴结转移组中的表达高于无淋巴结转移组(χ2=5.164，P=0.023)；STAT3蛋白在Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌中的阳性率逐渐增高，其中在Ⅲ期乳腺癌组织中的表达明显高于Ⅰ期乳腺癌(χ2=4.073，P=0.044)。同样的，STAT3 mRNA在有淋巴结转移组中的相对表达量(7.037±6.368)高于无淋巴结转移组(4.258±3.214)(P=0.019，图5)；STAT3 mRNA在Ⅰ～Ⅳ期乳腺癌中的相对表达量逐渐增高，其中在Ⅲ期乳腺癌中的相对表达量(7.285±6.722)明显高于Ⅰ期乳腺癌(3.975±2.040)(P=0.045，图6)；而STAT3 mRNA在不同肿瘤直径和组织学分级乳腺癌中的相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。

图5 STAT3 mRNA在有、无淋巴结转移乳腺癌组中的相对表达量

图6 STAT3 mRNA在Ⅰ、Ⅲ期乳腺癌中的相对表达量

2.4 STAT3 mRNA表达与乳腺癌患者预后的关系所有患者均接受手术治疗，随访时间17～60个月，中位随访时间43个月，平均43.6个月，生存63例，死亡15例。根据乳腺癌中STAT3 mRNA表达量中位数将STAT3 mRNA分为高表达组和低表达组，绘制维吾尔族乳腺癌患者术后5年STAT3高、低表达组的生存曲线，STAT3高表达组及低表达组患者术后的总生存率分别为73.477%(36/49)、93.10%(27/29)，STAT3高表达患者的中位生存期为48个月(95%CI：42.21～53.79)，STAT3低表达患者的中位生存期为54个月(95%CI：51.93～56.07)，两组比较差异具有统计学意义(Log-rank χ2=4.256，P=0.039，图7)。

图7 维吾尔族乳腺癌患者中STAT3 mRNA高表达及低表达组患者的5年生存曲线

3 讨论

乳腺癌是一种多基因性疾病，遗传基因易感性起着重要作用，其发病存在一定的种族和地域差异性[6]。新疆维吾尔族乳腺癌的发病率逐年增高，与汉族乳腺癌相比，具有发病年龄较早、分期较晚、淋巴结转移率高、预后较差等特点[7]，除饮食习惯、婚育情况等因素外，基因改变也是形成维吾尔族乳腺癌发病差异的重要因素。

Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)途径是整合细胞因子、激素和生长因子信号，以诱导或抑制细胞内基因表达的核心癌症途径之一[8]。STAT3蛋白是JAK3/STAT通路激活的关键因素，是目前公认的参与人类恶性肿瘤发生发展过程的最为重要的STAT家族成员。STAT蛋白家族是一组可以被多种细胞因子受体激活的相关蛋白，包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6共7个成员[9]，其中以STAT3研究最多，是多种恶性肿瘤已知的癌基因[10]。STAT3的活化受其上游JAK的调控，活化的JAK可以通过募集胞质中的单体STAT3分子，促进STAT3的酪氨酸磷酸化，磷酸化的STAT3形成同源二聚体进入细胞核，并与靶基因的启动子区结合激活转录[11]，STAT3持续激活可诱导细胞增殖、分化及凋亡，细胞向恶性转化，该途径在乳腺癌中尤为突出[12]。STAT3作为一种癌基因，在调节细胞增殖、分化、凋亡、血管生成、侵袭、转移等生物学过程中发挥重要作用[13]。研究表明：STAT3在乳腺癌、肝癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中呈高表达和异常激活状态[14-15]。文献报道STAT3过表达和激活参与了乳腺癌的进展、增殖、转移和耐药[16]。Sapio等[17]研究发现STAT3在乳腺癌组织中异常高表达，对肿瘤的发生发展起着重要作用。Li等[18]研究显示STAT3在乳腺癌组织中的表达与活化增强、临床分期和侵袭转移密切相关。

Sherona等[19]分析了710例乳腺肿瘤，发现STAT3在三阴型和HER-2过表达型乳腺癌中过表达，但在管腔型乳腺癌中无过表达。李玉柱等[20]研究显示STAT3在HER-2过表达型和Luminal A型乳腺癌中表达较高。本实验结果显示，STAT3蛋白在不同分子分型维吾尔族乳腺癌组织中的表达差异具有统计学意义(P<0.05)，STAT3在HER-2过表达型和三阴型乳腺癌中表达较高，而在管腔型乳腺癌中表达较低，其中HER-2过表达型乳腺癌组织中STAT3的阳性率高于其他分子分型乳腺癌。本研究显示：STAT3在不同分子分型维吾尔族乳腺癌中的阳性率与西方人群更接近，与汉族人群比较略有差异，提示HER-2过表达型维吾尔族乳腺癌的侵袭性较强。在维吾尔族乳腺癌中，STAT3蛋白和mRNA表达高于正常乳腺组织(P<0.05)；STAT3蛋白表达与肿瘤直径、组织学分级、淋巴结转移、临床分期相关(P<0.05)，提示STAT3表达越高，乳腺癌增殖速度越快，侵袭性越强，易发生转移，临床分期越晚，预后越差；STAT3 mRNA在不同淋巴结转移情况和TNM分期乳腺癌组织中的相对表达量差异具有统计学意义(P<0.05)，而由于样本量有限，本组STAT3 mRNA表达量在不同肿瘤直径和组织学分级中未发现统计学差异。绘制维吾尔族乳腺癌患者术后5年生存曲线，术后前30个月STAT3 mRNA高表达与低表达组乳腺癌患者的总生存率差别不明显，可能与乳腺癌患者术后行放化疗、靶向治疗或内分泌治疗有关，尤其是早期手术患者的3年生存率较高；STAT3高表达乳腺癌患者的总生存率低于低表达组患者，可能与临床分期较晚、不同分子分型和基因调控有关，STAT3可能参与调控维吾尔族非特殊类型浸润性乳腺癌的发生和发展，STAT3高表达可能是影响乳腺癌患者生存的预后因素。Khan等[21]研究显示：在乳腺肿瘤模型中抑制STAT3活性可减缓肿瘤生长，减少肿瘤相关炎症。有研究发现靶向STAT3和mTOR的联合治疗可能是乳腺癌的最佳治疗靶点[22]，STAT3可能成为一个有前景的人类肿瘤治疗干预靶点。目前，一些针对STAT3的特异性小分子抑制剂已经开发出来，寻找新的靶向STAT3激活药物仍然是一个重要的临床挑战。

综上所述，STAT3高表达可能影响维吾尔族乳腺癌患者的病变进展、增殖和转移，STAT3可能在维吾尔族乳腺癌的发生发展中发挥重要作用。本实验为研究乳腺癌的发生机制和治疗靶点提供理论依据，本课题组后续将扩大样本量进一步研究STAT3在不同民族间的表达差异，STAT3在乳腺癌中的作用有待于进一步探讨。