沙柳沙障沙埋段5种木腐真菌的生物学特性

段晓婷, 高 永, 梁钰镁, 王瑞东, 赵 晨, 郭 鑫

(内蒙古农业大学 沙漠治理学院, 内蒙古 呼和浩特 010020)

沙柳(Salixpsammophila)沙障是中国西北地区防沙治沙的主要工程措施之一[1-2]，能够在一定程度上改善土壤养分状况[3-4]，有利于增加沙丘表层细颗粒的含量明显降低地表粗化[5]，通过改变近地表风沙流结构[1]，有效控制土地沙化，且固沙成本较低[6]，所以被广泛用于荒漠化地区。然而，障体的使用效益具有一定周期，这主要是环境因子与微生物的综合作用[7]，沙柳沙障沙埋段腐化障体的主要腐解微生物为木腐真菌[8]，木腐真菌以菌丝体或孢子形式在沙柳沙障障体表面以及内部生长[9]，使障体细胞壁受到破坏，导致障体理化性质和物质组成发生变化，障体变得松软易碎，呈现出筛孔状或粉末状等形态[10]，最终导致沙柳沙障因破损发生倒伏。

木腐真菌是造成障体沙埋部腐烂的主要微生物[11]，其生长在各种形态的木材基质上[12]，木腐真菌通过分泌过氧化物酶和漆酶降解障体中的木质素和纤维素[13-14]使障体内部出现一系列细胞塌陷、空腔等腐化现象，且木腐真菌菌丝对木材C，N等营养元素具有重要的吸收和转移作用，促使障体物质组成发生变化[15]，从而失去其本身的价值。目前，关于沙柳沙障腐化规律、破损规律、作用机制、沙柳沙障对土壤的改良作用及其固沙效益等方面已得到一定的研究[1-6]，微生物作为沙柳沙障腐朽的主要原因，前人研究了不同垂直位置微生物数量的分布特征，及其与障体腐蚀之间的联系，以及致腐因子和防腐性能等方面[7-9]，相对于沙柳沙障腐朽过程中不同木腐真菌的生物学特性研究尚显不足。

基于此，本研究以分离自内蒙古自治区鄂尔多斯市独贵塔拉镇境内库布齐沙漠稳定沙埋段障体木腐真菌为研究对象，探究不同培养条件(碳源、氮源和酸碱度)对障体沙埋段木腐真菌生长的影响，以筛选其适宜的生长条件，初步了解障体沙埋段木腐真菌的生物学特性，以期为延长沙柳沙障使用周期提供理论依据。

1 研究区概况

研究区位于内蒙古自治区鄂尔多斯市独贵塔拉镇境内库布齐沙漠，地处鄂尔多斯高原脊线的北部(39°22′33″—40°52′14″N，106°55′16″—109°16′02″E)。研究区属于温带大陆性季风气候，年均降水量227 mm，年均蒸发量2 400 mm，地貌类型主要为流动沙丘、半流动沙丘和固定沙丘。土壤质地主要为壤土，以粉砂质壤土和砂质壤土为主，植被类型主要包括沙柳(Salixpsammophila)、甘草(Glycyrrhizauralensis)、花棒(Hedysarumscoparium)、柠条(Caraganakorshinskii)、杨柴(Hedysarummongolicum)和猪毛菜(Salsolacollina)等[16]。

2 研究方法

(1) 菌种制备。障体取自2019年11月3日，选取沿S24穿沙公路两侧已铺设5 a的沙柳沙障1 m×1 m规格样地，样品采集方法参照“树木病原真菌”的分离方式[17]来进行特定部位取样，使用经高温灭菌的枝剪剪取稳定沙埋段障体受真菌侵染的部位，无菌密封袋封装标记，低温保存运回实验室，于超净工作台上进行两种操作，一部分直接挑取障体表面菌丝进行分离培养，剩余部分用镊子夹取障体破损较严重部位碎木屑进行分离培养，在25 ℃恒温箱中培养。待平板上长出不同形态和不同颜色的菌落后，分别反复挑取直至获得纯菌株。接种于斜面培养基，存放于4 ℃备用。本试验使用的5种木腐真菌均为前期分离纯化保存于沙地植物抗逆生理实验室的菌种。将菌种接种于90 mm的PDA平板培养基上，25 ℃培养3～5 d，然后用已灭菌的打孔器(直径5 mm)在菌落边缘打取菌饼，用于固体和液体培养接种。

(2) 培养基。

①PDA培养基：马铃薯(去皮)100 g，葡萄糖 10 g，琼脂 10 g，蒸馏水 500 ml，蛋白胨 2.5 g，KH2PO41.5 g，MgSO40.75 g，VB10.005 g，氯霉素0.05 g。

②碳源基础培养基：以PDA培养基为基础，将葡萄糖用等量甘露醇、羧甲基纤维素钠、淀粉和麦芽糖代替。

③氮源基础培养基：以PDA培养基为基础，蛋白胨用等量尿素、氯化铵、硫酸铵和草酸铵代替。

④pH值基础培养基：以PDA培养基为基础，使用NaOH和HCl溶液调节培养基酸碱度。

(3) 不同碳源、氮源和酸碱度试验。①固体培养：用等量甘露醇、羧甲基纤维素钠、淀粉和麦芽糖代替不同碳源培养基中的葡萄糖；用等量尿素、氯化铵、硫酸铵和草酸铵代替不同氮源培养基中的蛋白胨；使用NaOH与HCl溶液调节培养基的pH值。将5种真菌分别接种于不同碳源、氮源和酸碱度培养基的中心位置，25 ℃恒温培养7 d，以接种块为中心每24 h测量菌落直径(mm)，设3个重复，每个重复随机测量3次，取平均值。计算菌丝日均长速[18]：

②液体培养：去除PDA培养基中的琼脂进行液体培养。于250 ml的锥形瓶中装入等量100 ml液体PDA培养基，每瓶接种1个菌饼，25 ℃，120 r/min摇床培养7 d，过滤收集菌丝并用蒸馏水冲洗3次，放于锡纸上，80 ℃烘干至恒质量后称量菌丝干质量(生物量)，每种处理3个重复[19-20]。

(4) 数据处理。采用Excel 2010对试验数据进行整理，使用SPSS 20.0(one-way ANOVA)分析对不同碳源、氮源和酸碱度下木腐真菌的平均生长速率以及生物量进行方差分析，并利用Duncan法进行差异显著性检验；使用Origin 2021软件绘图。

3 结果与分析

3.1 不同碳源对5种障体木腐真菌生长的影响

由图1可知，5种碳源下木腐真菌均可以生长。固体培养条件下，葡萄糖为桔绿木霉、Xs木霉、哈茨木霉和黑曲霉的最佳碳源，它们的生长速度分别为12.97 mm/d，8.56 mm/d，13.25 mm/d和5.22 mm/d。桔绿木霉、Xs木霉和哈茨木霉以葡萄糖为碳源较羧甲基纤维钠显著提高了52.6%，2.3倍和36.3%(p<0.05)；黑曲霉则在5种碳源下的排序为：葡萄糖>甘露醇>麦芽糖>羧甲基纤维素钠>淀粉。

注：不同大写字母表示同一碳源下不同木腐真菌间差异显著(p<0.05)；不同小写字母表示不同碳源下木腐真菌间差异显著(p<0.05)。下同。

液体培养条件下，同样桔绿木霉、Xs木霉、哈茨木霉、拟康氏木霉和黑曲霉以葡萄糖为碳源时生物量最大，其生物量分别为446.67，454.67，728.67，687.67，713.00 mg/100 ml。综上所述葡萄糖是5种碳源中最适合木腐真菌生长的碳源。

3.2 不同氮源对5种障体木腐真菌生长的影响

由图2可知，固体培养条件下，Xs木霉、哈茨木霉和拟康氏木霉最佳氮源均为蛋白胨，桔绿木霉最佳氮源为硫酸铵。其平均生长速度表现为：哈茨木霉>Xs木霉>拟康氏木霉；桔绿木霉则在以硫酸铵为氮源的培养基中平均生长速度最快13.06 mm/d。桔绿木霉、Xs木霉、哈茨木霉和拟康氏木霉以蛋白胨为氮源较以草酸铵为氮源平均生长速度显著提高61.0%，3.7倍、2.7倍和7.8倍(p<0.05)。液体培养条件下，桔绿木霉、Xs木霉、哈茨木霉和拟康氏木霉以蛋白胨为氮源时生物量最大，氯化铵为氮源时黑曲霉生物量较大。以蛋白胨的为氮源时生物量分别为473.33，453.00，558.33，526.33 mg/100 ml，黑曲霉生物量为610.00 mg/100 ml，且较其他氮源差异显著(p<0.05)。

图2 不同氮源对5种木腐真菌生长的影响

3.3 不同pH值对5种障体木腐真菌生长的影响

由图3可知，不同pH值使真菌的生长以及生物量产生差异。固体培养条件下，初始pH=5为Xs木霉、哈茨木霉和拟康氏木霉最适酸碱度，初始pH=6的培养基中黑曲霉生长速度较快，桔绿木霉在初始pH=5和pH=6的培养基中生长速度无显著差异(p<0.05)。其中Xs木霉、哈茨木霉和拟康氏木霉分别较pH=9平均生长速度显著提高4.1倍、78.0%和56.9%；桔绿木霉在初始pH=5和pH=6的培养基中生长速度为5.22，6.33 mm/d，黑曲霉在初始pH=6的培养基中平均生长速度为6.33 mm/d。综上所述，5种木腐真菌适合在弱酸性条件下生长。

图3 不同酸碱度对5种木腐真菌生长的影响

液体培养条件下，初始pH=7时桔绿木霉生物量较大，Xs木霉和拟康氏木霉最适酸碱度为初始pH=5，哈茨木霉和黑曲霉在初始pH=6时生物量较大。其中，桔绿木霉在初始pH=7时生物量为673.00 mg/100 ml，Xs木霉和拟康氏木霉较初始pH=9显著提高42.6%和22.7%(p<0.05)，哈茨木霉在初始pH=6时的生物量为591.00 mg/100 ml，黑曲霉则是较初始pH=9显著提高14.3%(p<0.05)。

4 讨论与结论

4.1 讨 论

充足的碳源、氮源和适宜的pH值是微生物生长繁殖所需的必要条件。碳源为微生物的生长代谢主要提供所需碳元素[21]，提供细胞生命活动所需的能量，其次氮源是作为构成生物体的蛋白质、核酸及其他氮素化合物的材料。pH值改变则会引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收，同时会影响酶的活性。明确障体木腐真菌生物学特性可对障体的腐朽机制及腐朽成因等方面的研究提供理论依据，从而延长障体使用寿命。

由于不同样本的木腐真菌群落对碳源利用的模式也存在一定差异[22]，本文研究的5种木腐真菌除拟康氏木霉以外，剩余4种木腐真菌最适碳源均为葡萄糖，这与Zeng等[23]对Phellinusbaumii的研究结果一致，可能是因为葡萄糖为单糖，真菌可以直接吸收与利用，但在Le等[24]对P.nebrodensis的研究得出最适碳源为麦芽糖，这与本文结果不一致，可能是二者所选的真菌类型不同，Le所选的真菌为百灵菇属于担子菌纲，主要引起白色腐朽，而本研究中哈茨木霉和黑曲霉属丝孢纲，因此其利用碳源的方式不同，将培养基内营养物质分解为自身需要简单碳水化合物的方式存在差异。

5种木腐真菌在不同的氮源培养基质下均能够生长，但对不同氮源的利用程度存在一定差异。除桔绿木霉最适氮源为硫酸铵和黑曲霉无最适氮源外，剩余3种木腐真菌最适氮源均是蛋白胨。该研究结果与顾琼楠等[25]对牛筋草炭疽菌的研究相悖。其研究发现，牛筋草炭疽菌最适氮源为酵母粉。可能是不同真菌群落所分泌酶的种类不同，代谢培养基内的营养物质的酶活性有所差异，其次代谢方式存在一定差异。本文中哈茨木霉、Xs木霉和拟康氏木霉在以蛋白胨为氮源的培养基中生长速度均达13.17，9.44，8.78 mm/d，这与Ha等[26]对P.japonica研究结果一致，原因是有机氮是一种植物、土壤和肥料相结合的含氮物质，所以有机氮较无机氮更有利于真菌的产生和积累一些代谢产物[27]，营养更加丰富，成分复杂。有机氮源除含有丰富的蛋白质、肽类、游离的氨基酸以外，还含有少量的糖类、脂肪和生长因子有利于木腐真菌的生长繁殖。同时，尿素作为氮源时，除黑曲霉平均生长速度较快以外，剩余4种木腐真菌平均生长速度均较缓慢，原因可能是尿素会使培养基pH值增大，影响菌株对培养基中营养物质的吸收速度[28]。

pH值是影响真菌生理和生长的主要因素之一，真菌通常仅限于在接近中性的狭窄 pH值范围内生长，许美玲等[29]研究发现外生菌根真菌在弱酸性条件下生长最好。在本文研究的5种木腐真菌中，固体培养条件下，桔绿木霉、Xs木霉、哈茨木霉和拟康氏木霉最适pH值为6，桔绿木霉和黑曲霉最适pH值为5。液体培养条件下，5种真菌大部分最适酸碱度集中在pH=6，同样是在弱酸性的条件下生长最好，与周慧杰[30]对外生菌根真菌的研究结果一致。同时，在龚萍[31]对沙柳沙障的研究中得出偏酸性的土壤能够促进沙柳沙障的腐蚀，证明了木腐真菌更适合在弱酸性条件下生长，原因是木腐真菌在碱性条件下会影响真菌细胞膜和离子的解离度，从而干扰木腐真菌对培养基中营养物质的吸收[32]，导致木腐真菌不能正常进行产物的积累以及代谢。

障体的分解主要是由于真菌的孢子和细胞的生长繁殖而引起的。木腐真菌需要在足够的条件下才可以生长，主要有营养、温度、水分和酸碱度等。孙芳利等[33]研究得出化学防腐可以封闭菌类，使菌类缺乏营养，以达到抑制其生长和繁殖的目的。本文通过对5种木腐真菌的研究得出其最适条件，因此可根据木腐真菌最适营养条件选择合适的化学药剂。如秦理哲等[34]研究发现ACQ防腐处理会引起马尾松木材酸碱性质、化学元素组成和官能团强度的变化，从而改变木腐真菌最适生长环境。范慧青[35]通过炭化处理降低木材酸碱度和减少木材碳源氮源的供给使真菌的生命活动受到限制。本文5种木腐真菌适合弱酸性条件，因此对于因腐朽进行定期更换的沙柳沙障来说，同样可以通过不同浓度的ACQ改变木腐真菌最适条件或对障体进行一定的处理改变障体为微生物提供的生存环境，以延长沙柳沙障使用寿命。

4.2 结 论

桔绿木霉、Xs木霉、哈茨木霉和黑曲霉的最适碳源为葡萄糖，羧甲基纤维素钠不适合作为5种木腐真菌的碳源；Xs木霉、哈茨木霉和拟康氏木霉3种木腐真菌最佳氮源为蛋白胨，草酸铵不适合作为Xs木霉、哈茨木霉和拟康氏木霉的氮源；5种木腐真菌均适合在弱酸性条件下生长，pH=9时5种木腐真菌平均生长速度变缓，特别是哈茨木霉不适合在pH=9的条件下生长。