猪肺炎支原体DJ-166 株高密度发酵工艺优化

陈丽萍 兆丰华生物科技（福州）有限公司 福州 350014

猪支原体肺炎 （Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS），又称猪喘气病、猪地方性流行性肺炎，是由猪肺炎支原体 （Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的以传染性高、发病率高和病死率低为主要特征的慢性呼吸道传染病，患猪常表现为咳嗽、喘气、呼吸困难等症状，是造成我国目前养猪业严重经济损失的传染病之一[1-2]。 猪支原体肺炎是一种慢性顽固性疾病， 抗支原体药可以抑制该病， 但难以根除，且停药后易复发产生耐药，故防控该病最好的方法是接种疫苗[3]。 目前国内弱毒活疫苗免疫原性较好，使用效果好，但主要通过胸腔注射、肺内注射或鼻腔接种，操作麻烦，推广受限，而进口灭活苗售价高[1,4]。 近年来，国产灭活疫苗研发速度加快，本文对猪肺炎支原体高密度发酵工艺进行优化， 为猪支原体肺炎灭活疫苗的制备提供参考依据。

1 材 料

猪肺炎支原体DJ-166 株： 由北京大北农科技集团股份有限公司研发中心提供；猪血清（经56 ℃、30 min 热灭活)、MEM 购自 Gibco 公司；PPLO 粉、水解乳蛋白购自BD 公司；酵母粉、脑心浸粉购自Oxoid 公司；NaCl、KCl、CaCl2、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、MgCl2·6H2O、酚红等均购自国药。

2 方 法

将猪肺炎支原体DJ-166 株冻干菌种按8%～10%比例接种到CH 液体培养基中，混匀，置37 ℃培养，观察颜色变化，pH 降至6.8 时收获菌液，经检验合格后作为一级种子。 以相同的方法进行二级种子繁殖， 经检验合格后作为二级种子。 以下除在2.1 项试验中有使用原始配方CH 液体培养基培养的种子， 其余均使用优化的CH 液体培养基培养的种子。

2.1 不同培养基对Mhp 繁殖的影响试验 分别在2 个50 L 发酵罐中加入含15%猪血清的原始配方CH 液体培养基、优化CH 液体培养基30 L，初始pH调为7.8， 取二级种子按8%接种量接种，37 ℃、50～150 r/min 培养， 当 pH 下降到 7.0、6.9、6.8、6.7、6.6时分别取样，测定CCU（颜色改变单位）。

2.2 培养基不同血清添加量比较试验 分别在3 个50 L 发酵罐中加入含10%、15%、20%猪血清的优化CH 液体培养基30 L，初始 pH 调为 7.8，取二级种子按 8%接种量接种，37 ℃、50～150 r/min 培养，当 pH 下降到 7.0、6.9、6.8、6.7、6.6 时分别取样，测定CCU。

2.3 培养基不同初始pH 比较试验 在3 个50 L发酵罐中加入含15%猪血清的优化CH 液体培养基30 L，初始 pH 分别调为 7.6、7.8、8.0，取二级种子按8%接种量接种，37 ℃、50～150 r/min 培养， 待 pH 降至 7.0、6.9、6.8、6.7、6.6 时分别取样，测定 CCU。

2.4 不同接种量比较试验 在3 个50 L 发酵罐中加入含15%猪血清的优化CH 液体培养基30 L，初始pH 调为7.8， 取二级种子分别按5%、8%、10%接种量接种，37 ℃、50～150 r/min 培养， 待 pH 降至7.0、6.9、6.8、6.7、6.6 时分别取样，测定 CCU。

2.5 大发酵罐培养 在1 000 L 发酵罐中加入300 L 含15%猪血清的优化CH 液体培养基， 初始pH 调为7.8， 取二级种子按5%接种量接种，37 ℃、50～150 r/min 培养， 待 pH 降至 7.0、6.9、6.8、6.7、6.6时分别取样，测定CCU。

2.6 菌液浓度测定方法 采用颜色改变单位（CCU）计数法[1]。 取 14 支无菌小试管，第 1～10 管每管加入1.8 mL 液体培养基 ， 第11～14 管每管加入1.6 mL 培养基； 在第 1 管加入 0.2 mL 待测菌液，混匀后，从中吸出0.2 mL 加入到第2 管，再混匀后取出0.2 mL 加入第3 管，以此类推，直到第10 管；从第8、9、10 管分别取出稀释好的菌液0.4 mL 加入到第 11、12、13 管 1.6 mL 培养基中； 第 14 管不加菌液作为对照。 37 ℃静置15 d，观察颜色变化，计算CCU 值。

3 结果与分析

3.1 不同培养基对Mhp 繁殖的影响 Mhp 对培养基的营养水平要求较高，自身合成能力也有限，需要添加多种复杂的营养物质[5]。 从培养时间上看，用优化的CH 液体培养基培养， 培养时间比用原始配方CH 液体培养基快 24～72 h。 由表 1 可知，用优化的CH 液体培养基培养， 菌液培养滴度最高能达到5×109CCU/mL，而用原始配方CH 液体培养基，菌液培养滴度最高只能达到1×108CCU/mL。

表1 不同培养基对Mhp 发酵的影响

3.2 培养基血清添加量的确定 血清的添加量是培养基营养水平的重要体现，对Mhp 发酵过程起重要作用。由表2 可见，在CH 液体培养基中添加10%血清时， 菌液培养滴度最高只能达到108CCU/mL；血清添加量为20%时， 培养液 pH 降到7.0、6.9 时，菌液培养滴度比添加15%血清时高，但是考虑到血清成本比较高， 且最高菌液培养滴度均为5×109CCU/mL，故生产时选用血清添加量为15%较为适宜。

表2 培养基血清含量对Mhp 发酵的影响

3.3 培养基初始pH 的确定 培养基初始pH 对Mhp 发酵起重要作用。 从培养时间看，培养基初始pH 为 7.6 时， 培养时间最短， 培养基初始 pH 为8.0 时， 培养时间最长。 由表 3 可见， 培养基初始pH 为 8.0 时， 菌液培养滴度最高只能达到 5×108CCU/mL，培养基初始 pH 为 7.6、7.8 时，菌液培养滴度最高分别能达到 1×109、5×109CCU/mL。 由此可见，培养基初始pH7.8 最为适合。

表3 培养基初始pH 对Mhp 发酵的影响

3.4 接种量的确定 从培养时间上看， 接种量为10%、8%、5%， 培养时间随着接种量的减少而增加；由表4 可知，接种量为10%、8%时，菌液培养滴度最高都能达到5×109CCU/mL，而接种量为5%时，菌液培养滴度最高能达到1×1010CCU/mL。 接种密度并不是越高越好， 接种密度较高会使支原体在繁殖早期消耗较多的营养物质， 使得支原体繁殖提早进入衰亡期[6]，所以，在Mhp DJ-166 株发酵过程中，接种量以5%较为适宜。

表4 接种量对Mhp 繁殖的影响

3.5 大发酵罐培养收获点的确定 根据以上试验结果， 在1 000 L 发酵罐中加入300 L 含15%猪血清的CH 液体培养基，初始pH 调为7.8，按5%接种量接种进行两批次试验。 由表5 可知，培养基pH 达到6.7 ～6.8 时， 菌液培 养滴度 最高 能 达到 1×1010CCU/mL，两批次菌液培养滴度相差不多。 因每次培养的培养量、营养水平、初始pH、接种量等并不一定相同，导致培养时间长短不一，为了避免培养过头或过早收获，经过多次试验验证，培养时通过pH变化情况来确定收获点， 菌液培养滴度批间差异较小。

4 讨 论

Mhp 对繁殖条件要求苛刻，需添加多种营养物质，而高密度发酵培养Mhp 对营养水平要求更加严苛，本试验通过对PPLO 粉、酵母粉、脑心浸粉、MEM等的添加比例进行优化， 使培养基在发酵培养中得到充分利用， 使培养周期缩短， 培养滴度从1×108CCU/mL 大幅度提高到 5×109CCU/mL。

Mhp 繁殖需要血清提供各种微量元素、 生长因子、维生素等，血清的厂家、添加比例对Mhp 繁殖影响很大。 郑铁鑫等[7]和李天增等[8]对不同厂家血清进行对比试验，结果表明不同厂家血清对Mhp 繁殖影响较大，培养滴度相差可达100 倍。 刘鹏等[9]用添加不同量猪血清的培养基培养Mhp HN0613 株， 表明添加15%血清的培养基培养最适宜，与本研究的结果一致。

王志国[10]通过改进Mhp 培养工艺，可缩短培养时间，培养滴度提高至109CCU/mL 以上。 培养基初始pH、接种密度、收获时的pH 等都是影响Mhp 繁殖的重要因素，朱秀同等[5]和刘鹏等[9]用发酵罐高密度发酵培养Mhp，通过对培养基初始pH、接种密度、通气量、搅拌速度、收获时间等进行优化，培养滴度分别达到 1×109CCU/mL、1×1010CCU/mL。 本研究用含15%猪血清的CH 液体培养基（初始pH 为7.8），按5%接种量接种，在培养基pH 达到6.7～6.8 时，菌液培养滴度最高能达到1×1010CCU/mL， 达到国内领先水平。本研究可为高密度发酵培养Mhp 提供参考，需注意的是，培养基初始pH、接种密度、收获时的pH 等与Mhp 菌株、活力、滴度、培养量等密切相关，应根据每个菌株情况、发酵工艺而进行优化。