不同抗原收获方式对猪繁殖与呼吸综合征病毒含量的影响

吴丽兰 兆丰华生物科技(福州)有限公司 福州 350014

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是危害养猪业的一个重大传染病，传播能力强，主要引起母猪的繁殖障碍， 仔猪断乳前后高病死率以及育成猪的呼吸道疾病[1]。 该病主要是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的病毒性疾病，可通过空气传播，引起免疫抑制和继发感染造成猪群的不稳定， 给养猪业带来巨大损失。目前，弱毒疫苗能够产生较好的细胞免疫，有效抵抗同源或相近的PRRSV 野毒感染，降低猪场发病率及稳定控制猪场疫情。 在弱毒疫苗生产中，抗原收获是决定疫苗质量的重要环节。本试验旨在通过对比PRRSV 抗原收获时上清液与细胞液之间的病毒含量差异以及冻干后的病毒含量，筛选出较为优势的抗原收获方式。

1 材 料

1.1 毒种 PRRSV（CH-1R 株），购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.2 细胞 Marc-145 细胞克隆株，兆丰华生物科技（福州）有限公司自主筛选。

1.3 试剂 MEM 基础培养基、胰酶，购自Gibco 公司；胎牛血清，购自兰州荣晔生物技术有限公司。

1.4 仪器设备 SAYO 二氧化碳培养箱、 倒置相差显微镜、GLZ-18 型冻干机、 漩涡型振荡器、 转瓶机等。

2 试验方法

2.1 细胞制备 选择处于对数生长期形成致密单层的Marc-145 细胞， 用0.25%胰酶-EDTA 溶液将细胞消化分散成细胞悬液， 按1:3 比例进行细胞分种， 用含胎牛血清和MEM 基础培养基的培养液进行细胞培养。

2.2 细胞接毒 待细胞培养52 h 长成致密单层后，挑选细胞，将细胞分为 A、B、C、D、E 五组，每组2 瓶（每组中的2 瓶细胞必须由同一个母瓶传出，分种率一样，细胞长满后肉眼看几乎无差异）。 弃去细胞所有的培养液，将PRRSV（CH-1R 株）按1%接种量接种，补足MEM 维持液。 置温室于37 ℃旋转培养，转瓶机转速为同一固定值。

2.3 抗原收获

2.3.1 收获时间 分5 个时间段收获抗原。 A 组收获时间较B 组提前4 h，B 组收获时间为抗原含量最高的时间点 （依据生产经验获得）；C 组收获时间较 B 组往后 4 h；D 组收获时间较 B 组往后 8 h，E组收获时间较B 组往后12 h（见表1）。每组又分为-1 和-2， 例如 A-1 代表 A 组上清液，A-2 代表 A 组细胞液。

表1 分组与收获时间

2.3.2 收获上清液 A-1、B-1、C-1、D-1、E-1 这5 组细胞到达预定收获时间后，轻轻摇晃细胞瓶，将病毒液分别收集到已灭菌的瓶中，取样、测定样品的病毒含量。

2.3.3 收获细胞液 将 A-2、B-2、C-2、D-2、E-2 这5 组细胞在规定的时间内收获， 放入-20 ℃冷库冻结， 第2 d 利用已经结冰的病毒液将瓶壁的细胞刮下来，待病毒液全部融化后，连同细胞一起收获，取样、测定样品的病毒含量。

2.3.4 冻干 将收获的 A-1、A-2、B-1、B-2、C-1、C-2、D-1、D-2、E-1、E-2 这 10 份样品配苗，加入明胶蔗糖冻干保护剂进行真空冷冻干燥。 取冻干完成的样品，测定样品病毒含量。

2.4 病毒含量测定 用MEM 维持液将每个待检样品作 10 倍系列稀释， 取 10-5、10-6、10-7、10-8四个梯度稀释液接种单层的Marc-145 细胞， 置37 ℃培养5 d，按 Reed-Muench 法计算 TCID50[2]。

3 结 果

3.1 上清液与细胞液病毒含量差异 A、B、C、D、E五组，按不同的收获方式分别收取上清液及细胞液，进行病毒含量测定，结果见表2。A 组和D 组上清液病毒含量略低于细胞液，B 组和E 组上清液病毒含量略高于细胞液，C 组上清液病毒含量与细胞液相同，通过分析上清液与细胞液病毒含量可知，两种收获方式获得的病毒含量差异不显著（P>0.05）。

表2 不同收获方式的病毒含量差异情况

3.2 上清液与细胞液冻干后病毒含量差异 A、B、C、D、E 五组 10 份样品冻干后，取样，测病毒含量，结果见表3。 B、C、E 三组冻干后的上清液病毒含量略高于冻干后的细胞液，D 组冻干后的上清液病毒含量略低于冻干后的细胞液，A 组则相同。通过分析上清液与细胞液冻干后的病毒含量可知， 冻干后效价差异不显著（P>0.05）。

表3 上清液与细胞液冻干后病毒含量差异

4 小结与讨论

在试验中， 为了证明上清液与细胞液之间的病毒含量差异不是在某一个点， 因此设计了病变具有代表性的5 个收获时间点。从试验结果来看，在收获抗原时，无论是收获上清液还是细胞液，它们之间的病毒含量差异并不显著。 有文献表明，PRRSV 的复制在胞浆中进行，在感染一定时间后，病毒粒子在细胞囊泡中成熟，并运输到浆膜，通过细胞胞吐作用外排子代病毒[3]，所以，上清液中的病毒含量也是随着病毒的繁殖规律相应变化的。

虽然上清液与细胞液效价差异不显著， 但是从它们的冻干制品还是可以看出上清液冻干后病毒含量总体会略高于细胞液， 可能是由于两者的收获方式不同造成的。 PRRSV 是一种有囊膜的病毒，在环境中不稳定[2]。 只收获上清液时，操作简单、时间短、冻损少。收获细胞液时，细胞内的一些病毒在收获时不是完全成熟的，而且收获操作过程繁琐、耗时长，增加了一次冻融，导致在冻干过程中耗损更大。这也是为什么细胞液的病毒含量不会每次都高于上清液的原因。

抗原只收获上清液， 不需要经过细胞冻融与刮苗这两道工序，可以减少相应的人力成本，减少冷库的面积，提高细胞瓶的周转频率，减少抗原的耗损，提高生产效率，几乎剔除了大部分细胞碎片，减少动物的临床过敏反应几率。鉴于以上结果，笔者认为收获上清液比收获细胞液在抗原的生产中更具优势。