以甘蓝中花青素为例探究数码成像比色法的应用

陈妍言 林丽

摘要：选择甘蓝作为实验材料，以电脑屏幕、96孔微孔板、手机和ImageJ作为数码成像比色法的主体，进行未知溶液含量的测定、酸碱滴定终点的判断。在学生已有知识的基础上，逐步接触到朗伯-比尔定律、导数法求解酸碱滴定终点。所有的实验材料均可以在生活中获得或找到对应的替代品。

关键词：比色;花青素;甘蓝;天然酸碱指示剂;微孔板;一阶导数;滴定终点

文章编号：1008-0546（2022）04-0084-04

中图分类号：G632.41

文献标识码：B

doi：10.3969/j.issn.1008-0546.2022.04.018

一、问题提出

比色法广泛运用于物质含量的检测，即根据溶液颜色的深浅判断物质含量的多少。可以分为目视比色法和分光光度法。目视比色法通过人眼对溶液颜色的判断，快速对大量样品进行分析，但精确度和准确度有限;分光光度法依据物质对特定光的定量吸收，由吸光度得到溶液的浓度，但需要使用昂贵的分光光度计，且学生困惑于仪器盒内仪器工作的原理[1]。解决办法之一是使用简单的材料让学生自主构建分光光度计[1]，学生通过分光光度计观察到光经过溶液发生的强度变化比他们只能看见等式、图解或者显示屏上的数字更加记忆深刻。分光光度计通常由光源、单色器、吸收池和检测器四个部分构成。生活中常见的材料可以用来构建简易“分光”光度计：光源用白炽灯、激光笔或LED代替[1];单色器使用光栅、DVD或CD光盘[1];比色皿用试管、试剂瓶等透明玻璃容器[2];检测器则使用光电二极管或智能手机[3]，其中可以用特定颜色的光，如红光，来达到光源和单色器“合并”的“分光”目的[2，4]。

近年来国内外有大量文献报道使用数码成像的方法进行比色，即在朗伯-比尔定律、RGB色彩空间模型的基础上，通过照相机、手机，将拍摄的照片输入到图像处理软件中进行数值分析。在测定物质含量上，数码成像比色法与分光度法相比，需要选取有代表性的物质，例如蓝色的硫酸铜溶液[4]、紫红色的高锰酸钾溶液[5]，即具有一定的局限性。不过，就测定物质含量和理解朗伯-比尔定律的教育目的上来看，数码成像比色法简单易理解、价格低廉且可以利用生活中常见的器材，在中学课堂或课外探究实验中都能实现。

在图像处理软件上，ImageJ优势明显，是生命科学领域常用的分析软件[6，7]。其中插件“readplate”可以在一分钟内读取96孔微孔板的图像信息[6]。已有文献报道微孔板可以与平板扫描仪配合使用，或直接用LED取代平板扫描仪作为光源[6]。

紫色果蔬如蓝莓、桑葚、紫甘蓝、紫薯等花青素含量丰富，营养价值高。花青素具有极强的抗氧化活性，可以有效清除自由基，广泛应用于延缓衰老、保护大脑和改善视力。且花青素在酸性条件下呈现红色，碱性条件下呈现黄绿色，可以代替酸碱指示剂判定滴定终点。

中学化学实验要求简单、有趣味和启发性。基于此，本文使用LED作为光源，96孔微孔板作为吸收池，手机采集图像并用ImageJ软件进行甘蓝中花青素含量的测定;在酸碱滴定曲线的基础上，借助高中数学一阶导数的简单知识进行滴定终点的判定[8]。

二、装置的构建

1.理解原理

利用学生已有的知识，如绿色植物呈现绿色是因为反射绿光，吸收绿光的互补光，展示自然界中的白光是一种光与其互补光复合而成;亦可使用office办公软件的调色盘展示白色由红、绿、蓝三原色组成[9]。

因此当白光通过一有色溶液时，溶液吸收的颜色与其本身互为互补色。物质与光的相互作用体现在物质对光的选择性吸收上。当强度为I0的光通过溶液时，溶液选择性吸收一部分光，透射另一部分光。吸收光强度和透射光强度之和为入射光强度。

I0=Ia+It吸光度被定义为入射光强度与透射光强度的比值的以10为底的对数。

而吸收光强度与溶液浓度、吸收池厚度呈现正比例关系，因此吸光度可以用来定量分析溶液浓度，即朗伯-比尔定律。

因此，当一束光透过红色溶液时，物质将选择性吸收互补光。通过软件分析透射光强度变化，即可获得吸光度变化。

在酸碱滴定曲线中，临近终点会发生pH的突变，即终点附近的斜率会陡然增大，在δpH/δV图像上能观察到最值[9];如果加入指示剂，可观察到指示剂颜色的改变，利用软件所得图像的强度也会发生类似于的突变。故可以收集滴定过程中的溶液，采集图像信息，绘制图像强度的一阶导数图，从而判定滴定终点。

2.设计装置

由于96孔板是平面裝置，可以直接将其放置在电脑屏幕上，在正上方70厘米处进行拍照，如图1所示。

三、实验

1.实验用品

新鲜甘蓝、DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱（上海鸿都电子科技有限公司）、粉碎机、筛网、Sartorius分析天平、无水乙醇（AR，成都市科隆化学品有限公司）、蒸馏水、无水柠檬酸（AR，成都市科龙化工试剂厂）、锥形瓶、量筒、棕色试剂瓶、96孔微孔板、玻璃比色皿若干、玻璃试剂瓶若干、100-1000μLDragonlab移液枪、烧杯、玻璃棒、7230G可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司）、电脑、手机。

2.实验过程（1）样品的制备

新鲜的甘蓝洗净，切成小块后放入烘箱于60°C烘干至恒重[10]。用粉碎机粉碎、过筛，装入样品袋于干燥处保存。

（2）花青素提取液的制备

称取1.0000g甘蓝粉末，加入50mL2%柠檬酸-60%无水乙醇于60°C提取两小时。到达预定时间后，过滤，收集滤液至棕色瓶中保存[10]。

（3）花青素浓度梯度液体的制备

用移液枪移取0-5mL的花青素提取液，分别加入到试剂瓶中，补加蒸馏水至10mL（表1）。

（4）溶液吸光度的测量打开可见分光光度计，预热20min后于波长525nm处测定吸光度[10]。（5）手机比色法测定样品吸光度使用PowerPoint制作白色的背景图，将花青素浓度梯度液体和未知浓度液体一同加入到96孔微孔板中，依照设计好的装置图摆放样品，用手机对样品进行拍照。将图片输入到ImageJ中，打开插件“read⁃plate”，框选左上角第一个孔至右下角第96个孔，如图2所示，设置采集孔的直径大小（不宜过大）和分析的通道[6]，输出数据至Excel中。

（6）氢氧化钠和盐酸的滴定

取20mL浓度大约为1mol/L的盐酸溶液于锥形瓶中，加入蒸馏水至200mL，加入指示剂，用已知浓度的氢氧化钠进行滴定，在特定的滴定体积处取200μL的溶液至96孔微孔板中，平行测定三组[8]，按照测定吸光度的方法采集图像信息。

四、结果分析

1.甘蓝吸光度分析

如图3所示，分别使用96孔微孔板和紫外-可见酚酞作为指示剂时，图像强度对体积的导数度测量时，两者均可以表现出很好的线性关系，满足分析的需求，但分光光度计的斜率明显大于微孔板所测，即灵敏度更高。其中，由96孔微孔板计算所得的未知溶液浓度为2.60mL/10mL，即真实加样浓度，当使用绿色和蓝色通道分析时，均可以得到相似的结果（图中未展示），红色通道则不能;紫外-可见光分光光度计所得为2.68mL/10mL，略微偏大。

当使用比色皿、玻璃瓶取代微孔板进行分析时，均可以取得很好的线性关系（R2>0.98），且分析结果也接近于真实加样浓度，即在无法获取微孔板时，便可以使用透光性好的玻璃材料代替。此外，还比较了多种获取RGB值的方法，如网页版的色彩拾取器、截图时的对话框信息，ImageJ点像素分析，结果表明，使用ImageJ中的插件“ROI”更能获取稳定的分析结果，且用于分析的区域位置信息可以以压缩文件的形式进行保存，方便查看和校对。以上均说明数码成像比色的适用性强，ImageJ分析方便快速。

2.酸碱滴定终点的判断

图4是酚酞作为指示剂进行酸碱滴定时绘制的一阶导数图像，图中的最值所对应的体积为21.625mL，因为NaOH浓度已知（用邻苯二甲酸氢钾标定），故可以求得盐酸的浓度为1.031mol/L。

圖5是甘蓝作为指示剂进行酸碱滴定时绘制的一阶导数图像，图中的最值所对应的体积为21.125mL，与酚酞作为指示剂相比偏小。由于酚酞的变色范围为8.2-10.0，因此，甘蓝作为指示剂能更好地指示滴定终点。

五、反思与展望

本文以甘蓝中的花青素为例，使用96孔微孔板的数码成像比色法对其含量和作为指示剂时滴定终点的判断进行了探究。含量测定结果表明，利用ImageJ图像分析结果与紫外-可见光分光光度计所得结果类似;酸碱滴定实验中，甘蓝的滴定终点更接近中性溶液。

96孔微孔板价格便宜，使用电脑屏幕作为光源代替平板扫描仪进行实验，同样可以获得很好的结果;实验中所使用的移液枪可以用1mL的医用微量注射器代替，后者便宜且容易获取，以上均说明以96孔微孔板的数码成像比色法推广到中学实验中的经济可行性。

运用生活中的材料甘蓝，提取花青素的操作简单，运用ImageJ分析图像并将数据导入到Excel中，操作熟悉时可在5min内完成，即满足中学实验课的时长限制。

利用学生对绿色植物颜色的已有认知以及高中数学涉及到的一阶导数知识，搭建“脚手架”，使学生逐步接触到物质对光的选择性吸收、朗伯-比尔定律，以及加深对滴定曲线的认识和滴定终点的判断。即本实验所涉及到的知识体现了学科交融的思想，同时也在学生的“最近发展区”内。

实验中体现的节约思想，如从低浓度到高浓度配制浓度梯度溶液，避免多次更换实验耗材;微量移取液体的操作;使用熟悉的手机进行化学实验......以上均可以引导学生对实验过程进行思考，增加实验过程的趣味性。

参考文献

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