基于网络药理学探讨活血健骨方治疗骨质疏松的潜在作用机制

曾豪杰，黄煜智，向世俊，陈倩文，周玉其，张维炊，杨 春*，杜以宽 (.广东医科大学干细胞与再生组织工程重点实验室，广东东莞 523808；2.东莞市人民医院中心实验室，广东东莞 523059）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种骨量减少、骨微结构损坏和骨脆性增加的全身性骨代谢紊乱疾病，属于中医“骨痿”、“骨痹”以及“骨痛”等的范畴[1]。《黄帝内经》认为,骨质疏松的发病机制以肾虚为本，与肝虚、脾虚以及血瘀也密切相关[2]。目前的临床治疗手段主要从促进骨形成和抑制骨吸收两方面入手来调节骨代谢，但较大的不良反应往往限制了相关药物的广泛应用，如常见的雌激素替代疗法可能会增加子宫内膜癌的发生风险[3]。

近年来，中医药治疗OP的疗效，特别是在改善患者疼痛及增加骨密度等方面的作用逐渐得到了临床认可[4]。活血健骨方是本课题的临床验方，该方可显著改善OP临床症状，但其分子生物学机制尚未明了。本活血健骨方由丹参、川芎、当归、土鳖、桑寄生、牛膝、地黄、鹿衔草、续断和五加皮构成，以补肾活血为治则，用于治疗骨质疏松，其中五味药物在《神农本草经》中均有记载：地黄，主折跌绝筋，填骨髓，长肌肉；续断，主伤寒，补不足，金疮痈，伤折跌，续筋骨；丹参，主心腹邪气，破癥除瘕；牛膝，主寒湿痿痹，四肢拘挛，膝痛不可屈伸，破瘀血。鹿衔草，主风湿痹历节痛，惊痫吐舌，悸气贼风，鼠瘘痈肿。本研究运用网络药理学的方法，整合中药、中药活性成分、中药靶标及疾病靶标等信息，从而探讨中药复方的作用机制，旨在为探索活血健骨方可能的预防及治疗骨质疏松症的机制提供新思路。

1 材料和方法

1.1 活血健骨方有效成分和靶点的收集

活血健骨方中的药材：丹参、川芎、当归、土鳖、桑寄生、牛膝、地黄、鹿衔草、续断以及五加皮。通过查阅文献，收集活血健骨方的活血健骨和治疗骨质疏松的成分信息。将收集到的有效成分通过Pubchem 数据库获得对应的SMILES 号，然后将SMILES 号输入Swiss 数据库(Swiss Target Prediction)进行靶点预测，收集各个成分预测出的Possibility 大于0 的靶点，最后去重得到有效成分的靶点。

1.2 疾病靶点预测

在GeneCards 数据库(https://www.genecards.org/)、TTD 数据库(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)、DRUGBANK 数据库(https://www.drugbank.ca/)中检索“Osteoporosis”获得与Osteoporosis 相关的靶点。然后汇总收集的靶点，最后去重后得到与Osteoporosis相关的靶点。

1.3 药材-成分-靶点图的构建

根据收集到的活血健骨方成分和成分对应的靶点，使用Cytoscape3.7.2软件建立“药材-成分-靶点”网络。再对网络进行分析，网络中的药材、成分和靶点由节点表示，节点之间由边来连接，表示节点的相关性。

1.4 蛋白相互作用网络的构建

将收集到的成分靶点与骨质疏松靶点取交集，得到活血健骨方成分抗骨质疏松的靶点，使用在线韦恩图绘制工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）绘制活血健骨方成分靶点和骨质疏松靶点的韦恩图，验证共同靶点。将靶点导入String 数据库(https://string-db.org/)，进行PPI网络构建，以分析靶点之间的相互作用关系，限定物种为“Homo sapiens”，其余参数为默认设置。将下载获得的TSV 文件导入Cytoscape3.7.2 软件，应用“Network Analyzer”功能进行网络拓扑分析，筛选自由度(degree)值高于平均值的靶点作为关键靶点。

1.5 生物过程与代谢通路富集分析

将活血健骨方成分抗骨质疏松的靶点对应的Gene symbol 列表输入DAVID，设置物种为“Homo sapiens”进行基因生物功能学(GO)富集分析和KEGG通路富集分析，然后使用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）将富集分析结果用气泡图和条形图的形式表示。

2 结果

2.1 活血健骨方成分筛选结果

基于“1.1”的条件对活血健骨方成分进行筛选，最终筛选得到61 个有效成分，并进行后续的网络药理学分析，如表1 所示。通过Swiss 数据库总共得到683个有效成分作用的靶点。

表1 活血健骨方61个成分及其基本信息

2.2 Osteoporosis靶点的获得

取GeneCards 数据库前500 个与Osteoporosis 有关的靶点，并在TTD、DRUGBAN 中找到全部与Osteoporosis 有关的靶点，汇总去重后，最终获得706 个靶点。

2.3 药材-成分-靶点网络的构建和分析结果

使用Cytoscape3.7.2 软件建立“药材-成分-靶点”的网络图，如图1 所示，图中包含754 个节点，其中10个蓝色圆形节点为药材，61 个红色菱形节点为活血健骨方成分，455 个绿色正方形节点为自由度值＜4 的靶点，228 个黄色三角形节点为自由度值＞4 的靶点。红厚壳内酯、槲皮素、汉黄芩素、黄芩素、黄藤素、山萘酚和木犀草素的自由度值较大。

图1 活血健骨方药材-成分-靶点网络图

2.4 PPI网络互作结果

将成分作用的靶点与骨质疏松症相关靶点用韦恩图取交集，得到活血健骨方有效成分抗骨质疏松的118 个靶点，如图2 所示。将118 个靶点导入String 数据库获得PPI网络数据，将数据导入Cytoscape3.7.2软件中构建PPI网络，见图3。该网络共涉及117个靶点(有1 个预测靶点无任何关联)和1 160 条边。筛选出了自由度值高于平均值的45 个核心靶点，如表2 所示。在PPI 网络中自由度值和combined-score 由小到大，则节点和边都逐渐增大，颜色均由红变蓝，PPI 网络显示，以ALB、IL6、EGFR、SRC、AKT1、MAPK3、ESR1、PTGS2等节点为中心，且自由度值较高。

表2 PPI网络中的核心靶点

图2 活血健骨方成分作用靶点与骨质疏松症相关靶点韦恩图

图3 活血健骨方抗OP的PPI互作网络图

2.5 生物过程与代谢通路富集

使用DAVID 对活血健骨方成分抗骨质疏松症的118 个靶点进行GO 功能富集分析（P＜0.05)和KEGG通路富集分析，分析结果见图4、5。

图4 GO功能富集分析结果

GO功能富集分析结果显示，在生物过程方面，这些靶点主要富集在氧化还原过程，对药物的反应，凋亡过程的正调控和转运等过程上；在细胞组分方面，这些靶点主要富集在细胞质膜、细胞外泌体、内质网膜、蛋白质复合物和细胞器膜等处；在分子功能方面，这些靶点主要与酶、血红素、铁离子、类固醇结合，同时还具有类固醇激素受体活性。

KEGG 富集分析结果显示，靶点主要富集在类固醇激素的合成通路、雌激素信号通路、癌症通路和TNF信号通路上。

2.6 分子对接

根据PPI 蛋白互作网络分析得到的关键靶点AKT1、IL-6和MAPK3，与活性成分槲皮素、山柰酚和木犀草素进行分子对接，得到结果如表3。

表3 关键靶点及其对应化合物分子对接结果

Ledock score 代表分子对接吻合度，分数越小代表配体与受体蛋白结合性越好，发生作用的可能性越大。可见，关键靶蛋白与成分的结合能均远远低于-5.0 KJ/mol。并对其进一步分析，得到各靶点与成分的3D 结合模型（图6）。化合物-靶蛋白对接图也显示化合物和靶蛋白能形成氢键等分子间作用力，进一步说明了筛选结果的可靠性。

图6 各靶点与药物成分相互作用的分子对接示意图

3 讨论

OP 是一种全身性骨骼疾病，表现为骨组织微结构退行性变和低骨量变，肾精亏虚、骨失滋养是本病发生的基本病机[5]。中医药治疗OP 具有价格低廉、剂型丰富、不良反应小、依从性好等优势，在治疗早中期OP 方面发挥着不可替代的作用[6]。“活血健骨方”是本课题组的临床验方，本研究以该方为研究对象，通过网络药理学和分子对接初步探究分析了其所含药物活性成分治疗骨质疏松症的潜在分子机制。

3.1 网络药理学结果简述

本研究基于网络药理学从PubChem和Swiss Target Prediction 数据库获得药物成分信息，收集到有效成分61 个，以红厚壳内酯、槲皮素、汉黄芩素、黄芩素、黄藤素、山萘酚和木犀草素活性较高，药物有效成分和疾病靶点交集118 个共同靶点，本研究将重点讨论PPI 中获得的IL6、AKT、MAPK 等核心靶点。分子对接结果显示，活血健骨方的3 个核心成分槲皮素、黄芩素、山柰酚与IL-6、MAPK3 和Akt1 显示良好的亲和力，氢键稳定，进一步验证该研究的结果。

3.2 活血健骨方治疗OP 的主要活性成分与作用靶点

Akt 是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游一系列底物,从而调节成骨细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等[7]。Zhong等[8]研究发现，槲皮素能促进Akt磷酸化进而促进成骨细胞的分化和钙化，并可以在一定浓度范围内以浓度依赖式诱导间充质干细胞分化成高浓度成骨细胞。黄芩素是黄芩根中的一种黄酮类化合物，具有抗炎及抗氧化活性等药理活性[9]。Lai等[10]研究表明，黄芩素通过激活AKT，ERK1/2 和JNK 信号通路刺激成骨细胞分化。Eun 等[11]发现，山柰酚通过激活PI3K、AKT，抑制CREB 以此减少成骨细胞变性起到预防和治疗骨质疏松等退行性疾病的作用。IL-6 是一种可以增强炎症反应的细胞因子，加速纤维细胞合成，导致软骨基质降解和破坏[12]。研究发现，黄芩素通过抑制TNFα、IL-6 和IL-1β 的功能，从而抑制破骨细胞分化和促进破骨细胞凋亡来抑制破骨细胞的骨吸收活性[13]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是存在于一系列哺乳动物中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是参与细胞分化、细胞增殖、细胞死亡和细胞运动等多方面的重要信号转导酶[14]。其家族细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、c-Jun 氨基端激酶(JNK)、p38MAPK 三种蛋白激酶已被认为对成骨细胞和破骨细胞的调节分化和激活至关重要[15]。Wong 等[16]研究表明，即使槲皮素对MAPK（特别是p38 MAPK 和JNK）的激活或抑制具有双相作用，所获得的最终结果仍是成骨细胞功能和破骨细胞凋亡的增强，以及成骨细胞凋亡的抑制；但具体机制并不明确，仍需多方面探讨[17-23]。

3.3 活血健骨方治疗OP的关键通路

活血健骨方治疗骨质疏松的KEGG 通路富集分析结果显示，主要富集在雌激素信号通路和癌症通路等。雌激素与骨质疏松的发生关联密切，现已验证雌激素在成骨细胞和破骨细胞上的表达表明骨细胞是雌激素的直接靶标，但在人体实验中仍需进一步验证其中分子机制的有效性[24]。雌激素-雌激素受体复合物的下游信号分子包括PI3K/Akt、MAPK（有丝分裂原激活的蛋白激酶）和PKC（蛋白激酶C）[25]。研究发现，可通过雌激素受体介导的PI3K/Akt（磷脂酰肌醇三激酶/蛋白激酶B）信号转导治疗骨质疏松[26]。PI3K/Akt 信号通路与成骨和破骨通路紧密联系,调控着成骨细胞和破骨细胞存活、分化过程从而维持骨量和骨转换平衡[27]。槲皮素通过调节PI3K/Akt 信号通路来治疗OP，其机制可能是：槲皮素通过增强ERK1/2 蛋白水平，促进RunX2 和OSX（成骨相关转录因子抗体）[18,28]，RunX2 可以上调PI3K P85 亚基、P110β 亚基和Akt的蛋白水平，从而增强PI3K/Akt信号通路活性，进而减少骨质疏松小鼠成骨细胞的凋亡，并促进小鼠成骨细胞增殖[29]。同时研究发现，山柰酚通过调节雌激素受体抑制破骨细胞自噬和成骨细胞凋亡，同时激活成骨细胞自噬来实现抗骨质疏松的作用[30]。Wnt/catenin 通路是癌症信号通路的下游通路[31]。Wnt/β-catenin 信号通路在骨骼形成、骨代谢中起到重要调节作用[32]。有动物实验表明，槲皮素可以通过增强Wnt3 和β-catenin 水平，降低LPS 诱导的MC3T3-E1 细胞的成骨性损伤[33]。山柰酚通过体内外实验验证，可通过Wnt/β-catenin 信号通路增强成骨活性，并提高Runx2、ALP 等的表达[34]。这些为活血健骨方以PI3K/Akt 和Wnt/β-catenin 信号通路治疗骨质疏松奠定理论基础。

3.4 小结

红厚壳内酯，汉黄芩素等药物成分虽有治疗骨质疏松的药物价值，但相关文献验证尚少，需要进一步实验验证。通过网络药理学技术研究活血健骨方治疗骨质疏松的潜在分子机制，发现研究主要集中于Akt、IL6 和雌激素信号通路来影响骨质疏松的进展。综上所述，应用网络药理学发现骨质疏松病因复杂，分子机制上治疗的方向不同，数据库检索得出的结果不一定全面，参数值的确定也应通过实验验证来提高可信度，但研究结果揭示了活血健骨方对多成分、多途径、多靶点的作用特点，在临床疗效确定的前提下，初步提供了活血健骨方治疗骨质疏松的潜在分子机制，为后续实验验证潜在分子机制奠定基础。