肺炎链球菌R6中Spr0934蛋白与铁色素相互作用机制的研究

王若男，熊兴东，刘新光，曹 锟*（广东医科大学.科研平台服务管理中心；.衰老研究所，生物化学与分子生物学研究所，广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞 53808）

肺炎链球菌是一种广泛存在于自然界中的病原微生物，它们属于革兰阳性菌，尤其较多存在于动物粪便、人体的咽喉部位[1]。该菌能够感染人体并造成感染性疾病，如呼吸道感染、鼻炎、扁桃体炎和肺炎等，也会对人体器官造成变态反应，如肾小球肾炎、菌血症、脑膜炎等重大疾病，对抵抗力较弱的婴儿和老年人具有极强的杀伤性[2]。病原微生物对于动植物的危害仍未得到解决，这也是人类共同面对的难题之一，为了解决这些问题，越来越多的科研工作者投入到病原菌的致病机制研究当中。

微量金属元素是细菌生存和发挥毒力必不可少的关键营养物质，它们通常作为金属蛋白或酶类的相互作用底物，这些蛋白只有结合金属离子之后才能激活其生理功能[3]。另外，金属离子也能够直接或间接参与细胞的生物合成和氧化应激等代谢途径，与病原微生物发挥粘附侵袭宿主细胞等生物功能密切相关。

本研究拟对肺炎链球菌R6中潜在的金属转运蛋白Spr0934 进行研究，采用多序列同源比对及生物信息学分析其活性中心的特点，通过分子对接技术测定该蛋白与铁色素的结合位点，最后利用分子动力学模拟的方法研究apo Spr0934 和Fc-Spr0934 的稳定性差异及其活性中心氨基酸残基的变化，将分析二者的回旋半径、溶剂可及表面积、均方根误差、均方根波动值以及二级结构含量等原子水平的指标变化，为阐明该蛋白与铁色素的相互作用机制提供了重要的理论基础，并为开发基于金属转运系统的抗菌药物提供重要的靶标。

1 材料和方法

1.1 分子对接

本研究采用的是Ledock 分子对接软件[4]（http://www.lephar.com/download.htm），Spr0934 的蛋白结构（PDB:4h59）和铁色素的结构均来源于RCSB 蛋白质数据库网站（https://www.rcsb.org/）。首先应用VMD软件对铁色素的PDB 结构生成mol2结构，通过VMD软件选定目标蛋白Spr0934 的活性区域，即设置boxer xmin xmax ymin ymax zmin zmax。最后执行分子对接ledock，并获得配体分子的poses 及结合能量进行分析。

1.2 分子动力学模拟

基于上述分子对接获得的Fc-Spr0934 复合物以及apo Spr0934 结构，采取Gromacs2020.4 软件包分别对二者进行计算生物学模拟。进行分子模拟计算之前，需要先除去apo Spr0934 和Fc-Spr0934 结构中的结晶水和杂质离子，设置两个独立的体系，采用SPC水模型、amber99sb-ildn 力场进行总时长为30 ns 的仿真模拟。将apo Spr0934 和Fc-Spr0934 的蛋白结构放置在立方周期盒中并作为起始构象，设定蛋白与盒子边界的最小距离为1.0 nm，模拟系统的周期性边界条件适用于X/Y/Z 3 个方向[5]。溶胶中加入0.15 mol/L NaCl 盐溶质以便中和蛋白体系的电荷。采用蛙跳算法计算每个原子的运动，用粒子网格法计算PME 静电相互作用，利用最速下降能量法进行400 步能量最小化，分别对apo Spr0934 和Fc-Spr0934 进行50 ps 的位置约束模拟。正式动力学模拟的初速度被设置为随机速度，以保证模拟的随机性[6-7]。利用PyMOL、VMD以及Origin8.5软件生成数据结果。

1.3 分子模拟结果分析

利用VMD-1.9.1 软件观察两个不同模拟体系的轨迹中蛋白构象变化[8]，采用gmx rms、gmx rmsf 和gmx gyrate 工具分别计算蛋白的RMSD 变化、每个氨基酸残基的α-C 的均方根涨落RMSF 以及回旋半径Rg 值[9]。根据gmx distance分别测定apo Spr0934 和Fc-Spr0934 中铁色素的直接相互作用的位点残基（Asn-83、Tyr-133、Tyr-225 和Arg-231）的溶剂可及表面积SASA 值。并通过PyMOL 和Origin8.5 软件分别绘制结构图与曲线图。

2 结果

2.1 分子对接预测Spr0934 的活性中心及铁色素的结合位点

通过Ledock 的全局性对接，共得到15 个对接模型，其中8 个对接结果均呈现在同一个区域，且这些poses 的对接能量最低，说明该模型的合理性最高。此时，铁色素被结合在Spr0934 的活性中心凹槽处，这与同源模板4HMQ的铁色素结合区域基本一致（图1A），说明此处为配体分子的优势结合区。与铁色素结合的氨基酸残基分为两类，即直接和间接相互作用，其中Asn-83、Tyr-133、Tyr-225 和Arg-231 直接与铁色素形成氢键结合，而Ala-82、Tyr-84、Trp-158 和Phe-255则起辅助作用（图1B）。

图1 分子对接结果的全局性展示

2.2 模拟过程中蛋白的均方根误差及残基的波动性分析

均方根误差(root mean square deviation,RMSD)通常被用于监测蛋白构象与原始结构之间的平均偏差，这是衡量体系是否达到平衡状态的重要依据。蛋白整体构象波动性结果表明，Spr0934 在结合铁色素时的RSMD 值更低，大约在10 ns 即进入相对平衡状态（图2A），apo Spr0934则在30 ns的模拟体系中则无法达到平衡，说明apo 蛋白不稳定，而结合铁色素能促使蛋白构象稳定。

统计每个原子相对于其平均位置的涨落（RMSF）值的变化，可以分析得出每个氨基酸残基的灵活性差异。与apo Spr0934 相比，Fc-Spr0934 的大多数残基RMSF 值较小（图2B），尤其是与铁色素存在相互作用的8 个氨基酸残基更加稳定。该结果说明，蛋白结合铁色素之后不仅能引起结合位点残基灵活性降低，而且能促使蛋白整体趋于稳定。

图2 蛋白整体构象波动性及氨基酸残基灵活性展示

2.3 蛋白的回旋半径和溶剂可及表面积分析

分别统计两个蛋白的回旋半径（Rg）随模拟时长的变化情况，Rg 值越大表示蛋白构象灵活性较大，而该值越小则说明构象越趋近于刚性。在apo Spr0934和Fc-Spr0934 的体系中，蛋白骨架α-C 的Rg 值在30 ns 时分别达到了2.07 nm 和2.04 nm（图3A），说明apo形式的蛋白柔性较大故其对应的Rg 也较高；而铁色素被结合在活性中心后，蛋白整体则呈现出刚性即灵活性降低，该结果与常见的底物结合蛋白的特性相一致。溶剂可及表面积（SASA）的统计结果也说明了这一点，apo Spr0934 和Fc-Spr0934 蛋白整体构象的SASA 值分别为154.5 nm2和147.9 nm2（图3B）。然而，单独统计与铁色素直接相互作用残基（Asn-83、Tyr-133、Tyr-225 和Arg-231）的SASA 值，发 现Fc-Spr0934 组 的SASA 值 为12.7 nm2，高 于apo Spr0934组的12.1 nm2（图3C），这可能是由于蛋白的活性中心凹槽在apo 状态下处于“closed”状态，而结合铁色素会造成其转为“opened”状态。

图3 蛋白骨架的回旋半径及溶剂可及表面积分析

2.4 apo Spr0934 和Fc-Spr0934 的二级结构含量变化及构象差异

为分析结合铁色素对蛋白二级结构含量造成的变化，笔者采用do_dssp 插件解析蛋白的二级结构含量。统计结果显示，apo Spr0934 蛋白结构中平均有66 个残基参与形成无规卷曲，99 个形成α 螺旋（图4A）；而在Fc-Spr0934的结构中平均有54个残基参与形成无规卷曲，107 个则形成α 螺旋（图4B）。该结果说明，铁色素的结合将促使一部分无规卷曲含量向α螺旋转变，最终导致二级结构含量占比发生改变。为直观反映出铁色素结合导致的蛋白空间构象变化，笔者分析了30 ns模拟时长内apo Spr0934与Fc-Spr0934的平均结构，结果显示apo 形式的蛋白则更为松弛，而铁色素结合蛋白整体更加紧凑（图4C），这可能是由于铁色素将活性中心凹槽附近的残基距离拉近所致。

图4 蛋白二级结构含量变化及构象差异

3 讨论

据文献报道，铁转运蛋白是肺炎链球菌发挥粘附侵袭能力的关键[10]，然而自然界中常见的铁源有血红素、铁色素、三价铁离子及二价铁离子等[11]。对于铁色素结合蛋白的研究，有助于补充细菌的铁转运机制。笔者针对肺炎链球菌R6 中的假定蛋白Spr0934进行研究，通过分子对接技术筛选到铁色素与蛋白结合的最佳构型，确定了潜在的铁色素结合位点残基为Asn-83、Tyr-133、Tyr-225、Arg-231 和Ala-82、Tyr-84、Trp-158、Phe-255，其中前4 种为氢键形式结合，后4种为辅助形式结合。然后，通过分子动力学模拟优化了复合物结构，并证实铁色素的结合会导致蛋白质整体的RMSD、RMSF、Rg 及SASA 值降低，这将促使复合物蛋白的稳定性升高。铁色素的结合将导致蛋白二级结构组分占比发生改变，即促使一部分无规卷曲含量向α 螺旋转变。总之，本研究在原子水平上揭示了Spr0934 与铁色素的相互作用机制，为以该蛋白为靶标设计抗菌药物提供了理论基础。