基于宏基因组学技术的炎症性肠病小鼠的运动干预研究

2022-04-01胡双双董静梅

中国体育科技 2022年2期

胡双双，俞益，董静梅 *

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一种高发的慢性疾病，被称为不是癌症的“癌症”（Backhed et al.，2005），表现为长期复发性炎症细胞浸润肠壁，患者反复发生腹痛、腹泻、黏液血便，甚至出现各种全身并发症，因而导致该病的治疗疗程长达数年，甚至需要终身服药。近20年来，因饮食习惯改变和环境因素影响，我国炎症性肠病患者的数量呈进行性增加，近5年的病例数是20世纪90年代同期的8倍（Dolan et al.，2017）。这种疾病高发于青壮年时期，在患病30年后发展为结直肠癌的风险高达18%。因此，鉴于该病在我国的高发性、反复性和诱癌性特点，其药物治疗又存在周期长、潜在副作用多和疗效显著性差等医学难点，IBD的预防与替代治疗成为国内外探究的热点。已有研究证明，适度运动在肠道免疫和肠道微生态的调控上具有良好作用（Cook et al.，2013；Saxena et al.，2012）。基于此，本研究通过建立小鼠的IBD模型，利用高通量测序和宏基因组学测序技术，探索与IBD肠道相关联的肠道功能性优势微生物群落。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

无特异病原体（specific pathogen free，SPF）清洁级4～6周龄的C57雄性小鼠22只，体质量为（18.0±2.0）g，随机分为4组：安静对照组（C组，n=5），运动对照组（E组，n=5），炎症性肠病安静组（IC组，n=7），炎症性肠病运动组（IE组，n=5），分组后进行耳标编号。SPF级鼠房饲养，自由进食、饮水，室温为20℃～25℃，相对湿度为45%～55%，每日光照时长为12 h。

1.2 炎症性肠病造模

采用浓度为5%的葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS；M=35～50 kDa；Sigma-Aldrich St.Louis，United States）水溶液，自由饮用1周构建小鼠的炎症性肠病模型，以每只小鼠每日体质量下降百分比、大便性状和便隐血程度检测小鼠炎症性肠病的疾病活动情况。造模结束后，从IC组随机选取2只小鼠进行结肠评估。

1.3 运动方案

实验结合Cook等（2013）和Saxena等（2012）的运动方案，选取中低强度来制订运动负荷，采用BCPF-98型生物医学动物跑台进行训练。运动适应1周后，进行为期6周的阶梯递增式中低强度跑台运动，每周训练6天，每天运动30 min，每日称重，通过血清C反应蛋白与MPO来评价运动强度是否对小鼠机体产生应激反应（表1）。

表1 小鼠跑台运动的干预方案Table 1 Treadmill Training Protocol for Mice

1.4 取材

小鼠分组编号后，每周取每只小鼠的粪便样本，-80℃冻存。在小鼠6周训练结束36 h取血液样本后，测量4组小鼠结肠长度，并对结肠进行评分后用冰PBS溶液冲洗结肠内容物，将标本置于4%中性甲醛中固定，待制成石蜡切片。

1.5 指标检测

1）疾病活动性指数（disease activity index,DAI）、组织学损伤评分、宿主免疫表达和肠道微生物群落变化。疾病活动指数：DAI=（体质量指数＋大便形状＋出血情况）/3（表 2）。

表2 小鼠DAI评分标准（Mi-Rae et al.，2017）Table 2 Criteria for Scoring of DAI

2）炎性因子：运动干预结束36 h后，取约2 mL血液，静置后在5℃下以3 000 r/min的转速提取血清，ELISA测试方法检测宿主血清IL-1β、IL-10、TNF-α和MPO。

小鼠结肠大体观察及评分：测量每只小鼠的结肠长度，并对结肠大体的健康情况进行评定（表3）。

表3 小鼠结肠大体评分标准（Morris et al.，1989）Table 3 Criteria for Scoring of Gross Morphologic Damage

小鼠组织学观察及评分（表4）：随机取含病变的结肠组织，去除肠内容物，以4%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，H.E.染色，显微镜观察。

表4 小鼠结肠组织学评分标准（Scheiffele et al.，2002）Table 4 Criteria for Scoring of Histological Damage

微生物群落特征变化：对每周冻存的粪便样本进行高通量16S rRNA基因测序，Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析，可以对OTU进行多种多样性指数分析，以及对测序深度的检测；基于分类学信息，可以在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。在上述分析的基础上，可以对多样本的群落组成进行差异显著性检验，对其系统发育信息进行多元可视化分析。

DNA抽提和PCR扩增：根据E.Z.N.A.®soil试剂盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）说明书进行总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000检测，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；用338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和 806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物对V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序为：95℃预变性3 min，27个循环（95℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s），72 ℃延伸10 min（PCR仪：ABI GeIEAmp®9700型）。扩增体系为20 uL，4 uL 5×FastPfu缓冲液，2 uL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 uL 引物（5 umol/L），0.4 uL FastPfu聚合酶，10 ng DNA模板。

1.6 统计方法

采用UPARSE软件，根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，并在聚类的过程中去除单序列和嵌合体。利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库（SSU123），设置比对阈值为70%。其余数据均采用SPSS 25.0统计软件处理，用平均值±标准差表示。组间比较分别采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01为差异有高度显著性。

2 研究结果

2.1 造模评估

炎症性肠病造模期间，每日对造模组小鼠进行便隐血测试并记录测试结果，造模第4天便隐血程度＋＋＋及以上达50%，第5天便隐血程度＋＋＋及以上达75%，第7天便隐血程度＋＋＋及以上达100%。

造模1周后，从IC组随机选取2只小鼠进行结肠组织学观察，作为本次炎症性肠病造模评价。与正常对照组比较，DSS诱导IBD造模后小鼠肠道组织发生了明显的病理改变（图1），小鼠肠隐窝结构遭到破坏、杯状细胞消失、肠粘膜溃疡形成，可见大量炎性细胞浸润，肠壁增厚，高倍镜下有多发的出血点。

图1 小鼠结肠内膜的病理组织学变化（×200）Figure 1.Histopathological Changes of Colonic Intima in Mice（×200）

结合IBD造模小鼠便血情况和组织学观察结果，判定本次炎症性肠病小鼠模型造模成功。

2.2 小鼠对跑台运动的反应与适应

安静对照组（C组）和运动对照组（E组）在运动训练前后均活泼好动，皮毛紧密光滑，干净润泽，目光有神，体质量稳步增长。炎症性肠病安静组（IC组）与炎症性肠病运动组（IE组）在造模期皮毛枯槁，目光倦怠、惊惧，反应迟钝，肛门脱垂，体质量严重下降。运动干预期结束后，IE组小鼠比IC组更为活泼，毛色更为光亮，大便性状更为健康。

实验前，各组小鼠体质量无显著性差异（P＞0.05）；造模结束后，IC组与IE组体质量显著下降（P＜0.05）；运动干预后，E组与IE组体质量均显著增加（表5）。

表5 实验前后各组小鼠体质量变化Table 5 Changes in Mice Body Weight During Breeding in Various Groups M±SD，g

运动后，通过监测小鼠全血C反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）来评价小鼠对采用的跑台运动的适应情况。研究表明，运动能够降低小鼠全血CRP［安静组（2.78±0.13）mg/L，运动组（2.25±0.34）mg/L］的含量。说明本次负荷的跑台运动作为一种运动刺激，其强度和运动量构成的运动负荷未对小鼠产生应激反应，表明本研究的运动建模是一种良性适应。

2.3 DAI及结肠病理评分

2.3.1 小鼠结肠DAI分析

实验前后，对小鼠进行炎症性肠病的DAI评分（图2a），取材后对小鼠结肠进行组织学评分（图2b）。运动前中期（1～4周），IC与IE组的DAI评分均有所下降，IE组降幅高于IC组，提示低强度有氧运动对炎症性肠病有转愈效果；运动后期（5～6周），IE组DAI回升，提示后期可能由于运动强度的升高，导致炎症性肠病的反复。

图2 运动干预下IBD小鼠结肠DAI评分及组织学评分变化Figure 2.Changes of DAI and Histological Score in Colon of IBD Mice after Exercise Intervention

2.3.2 造模与运动干预后小鼠结肠的病理组织学分析

经过H.E.染色，正常对照组（C组）小鼠肠腺清晰、排列整齐、无明显炎性细胞浸润、绒毛排列整齐、无明显断裂。与正常对照组比较，DSS诱导IBD造模后小鼠肠道组织发生明显的病理改变，小鼠肠隐窝结构遭到破坏，可见大量炎性细胞浸润，绒毛排列杂乱无序，可见明显断裂，绒毛长度缩短，肠壁增厚，杯状细胞消失，高倍镜下有多发的出血点。运动干预期结束后，与IC组相比，IE组的炎症浸润明显减少，肠道腺体结构有所恢复，杯状细胞数量有所增加（图1）。

2.4 小鼠肠道微生物的变化

2.4.1 肠道微生物OTU聚类及物种多样性变化

根据宏基因组学技术，PCR正式采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL 反应体系，通过16 s rRNA测序技术得到各样本的序列，UPARSE软件根据97%的相似度对序列进行OTU聚类，一共获得901 122条有效序列（397 857 710 bp），平均长度为441.472 580 317。再通过 OTUs（Operational Taxonomic Units）聚类和丰度统计，对测序中的有效数据进行处理。

通过各组菌属总和的比较发现，IBD建模组菌群属种数明显降低，而IE组较IC组有一定的增加趋势，但未有显著差异性变化（图3a）。E组小鼠肠道菌群数量显著高于其他组（图3b）。

图3 运动干预和造模后各样本的菌群数量的多样性变化Figure 3.Microbial Diversity Changes after Exercise Interventionand IBD Modeling

2.4.2 运动干预后小鼠肠道优势菌群的群落特征分析

在门水平上，物种肠道的群落组成分析发现：IBD造模引起拟杆菌门（Phylum Bacteroidetes）显著减少，运动后IC组有升高趋势；正常小鼠和IBD小鼠肠道内厚壁菌门（Phylum Firmicutes）、放线菌门（Phylum Actinobacteria）、Saccharibacteria菌门和疣微杆菌门（Phylum Verrucomicrobia）均显著增加，拟杆菌门（Phylum Bacteroidetes）显著减少，IBD造模后菌群种属的多样性增加；同时，运动减少了正常小鼠肠道内变形杆菌的数量（图4a，表6）。门水平的优势群落的差异性分析显示，运动引起的小鼠肠道内厚壁菌门（Phylum Firmicutes）、放线菌门（Phylum Actinobacteria）、Saccharibacteria菌门和疣微杆菌门（Phylum Verrucomicrobia）的增加具有显著性水平（图4b）。

图4 各组小鼠肠道微生物群落组成分析与单因素方差分析Figure 4.Intestinal Microbial Community CompositionAnalysis and One-WayANOVAof Each Mice

2.4.3 运动干预后小鼠肠道优势菌群的物种组成分析

在优势群落变化特征的基础上，对C组、E组、IC组和IE组各样本进行物种组成的差异分析（表6），根据得到的群落丰度数据，进行组间差异显著性检验，运用统计学方法检测4组微生物群落中丰富度存在差异的微生物：1）与C组相比，E组的Firmicutes菌显著增加（P＜0.05），IC组的Firmicutes菌增长更为显著（P＜0.000 1）；与E组相比，IE组的Firmicutes显著增加（P＜0.000 1）；与IC组相比，IE组的Firmicutes有所增加但未达到显著差异（P＞0.05）。2）IB造模引起E组的Actinobacteria菌门显著升高（P＜0.000 1），运动干预后显著逆转Actinobacteria菌门增加的趋势（P＜0.05）。3）与C组相比，E组的Saccharibacteria菌门丰度有所升高，IBD造模同样引起该菌门物种的丰度显著升高（P＜0.05），运动并没有逆转该菌门丰度升高的趋势，提示该菌门是一种对造模炎性刺激和运动刺激非常敏感的菌属群落。4）与C组相比，E组疣微杆菌门（Phylum Verrucomicrobia）显著增加（P＜0.000 1），但IBD造模后和运动干预后均无显著性变化。5）与C组相比，IBD造模组后拟杆菌门（Phylum Bacteroidetes）均显著下降（P＜0.05），但运动干预后拟杆菌门丰度具有逆转增加的趋势（P＜0.05）。提示，拟杆菌门丰度可作为干预IBD肠道菌群的靶向干预群落。

表6 各组肠道微生物群落变化特征的组间单因素分析表Table 6 Characteristic Changes of Intestinal Microbial Community under One-WayANOVA

2.5 宿主功能与免疫炎性因子的变化

在健康小鼠中，运动组血清IL-10、TNF-α和MPO的表达量均显著高于安静组；在炎症性肠病小鼠中，运动组IL-1β和IL-10的表达量均显著高于安静组（表7）。

表7 运动干预后小鼠血清炎性因子的变化Table 7 Serum Immune Expression of Mice after Exercise Intervention M±SD

3 分析讨论

3.1 运动通过改变肠道菌群的组成促进宿主肠道健康

根据本实验宏基因组学的16sRNA测序的结果表明，在门水平上，运动后正常小鼠和IBD小鼠肠道内厚壁菌门、放线菌门、Saccharibacteria菌门和疣微杆菌门均显著增加，拟杆菌门显著减少，菌群丰度增加。运动增加厚壁菌门，而厚壁菌门（如毛螺菌属、瘤胃球菌属等多种菌群）可代谢产生产丁酸盐（OH et al.，2014）。丁酸盐对肠道起到很好的保护作用，可调节NF-κB活化引起的结肠癌和炎症等肠病，还可影响肠道微生物环境组成并降低肠道pH值，起到促进结肠上皮细胞的增殖和降低结肠直肠癌风险的作用。同时，大肠中丁酸盐的产量，与肠上皮细胞的健康和维持肠上皮细胞功能结构的热休克蛋白70（Hsp 70）的产量密切相关（Oh et al.，2014；Jiang et al.，2017）。

研究证实，肠道变形菌门能够反映微生态失调或者不稳定的肠道微生物群落结构（Neish et al.，2014；Sokol et al.，2017；Takahashi et al.，2016）。健康的哺乳动物肠道含有变形菌的共生细菌，当这些细菌的数量较少时，表现为良性，但在某些肠道环境下，会成为可以引发肠炎的肠道微生物。在单纯运动组，健康小鼠运动干预后的变形菌门的种属低于安静组，提示适度运动可通过改变小鼠肠道致病菌的种类，从而有利于改善机体肠道的微生态平衡；但在IBD建模以后，运动组的变形菌门数量反而高于安静组，提示小鼠在炎症性肠病和运动的双重刺激下，微生态失衡加剧，因此在炎症性肠病小鼠的运动干预中，对运动强度的把控要求更为严格。本实验选择小鼠C反应蛋白和MPO作为适度运动的强度把控指标。

3.2 运动调节宿主免疫表达改善机体慢性炎症状态

本实验中，健康小鼠运动组血清IL-10、TNF-α和MPO的表达量均显著高于安静组；在炎症性肠病小鼠中，运动组IL-1β和IL-10的表达量均显著高于安静组。研究发现，IL-10作为血清中重要的抑炎因子，具有广泛抑炎作用和对机体肠道上皮细胞的炎症抑制特异性（Bermon et al.，2015；Sartor et al.，2017）。健康小鼠运动组的 IL-10 表达量显著高于安静组，说明运动对健康小鼠有广泛抑炎效果；同时，IBD小鼠运动组的IL-10表达量显著高于安静组，结合H.E.染色光镜分析和DAI评分提示的运动转愈效果，说明运动提高IBD小鼠体内的IL-10表达量对IBD小鼠的肠炎有转愈效果。

髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）是中性粒细胞的功能和激活的生物标志物，其水平及活性变化代表嗜中性多形白细胞（polymorphonuclear，PMN）的功能和活性状态。研究发现，MPO不仅能杀灭吞噬细胞内的微生物，而且可以释放到细胞外，破坏多种靶物质，在机体的炎症调节中发挥作用（Chevrier et al.，2003）。然而在特定条件下，MPO催化反应生成过量的氧化剂（HOCL、3-次氯酸络氨酸、络氨酰基等）超过局部抗氧化剂的防御反应时，就会导致氧化应激和氧化性组织损伤。本实验中，健康小鼠运动组MPO的表达量显著高于安静组，而运动对IBD小鼠MPO的表达量有提高但不显著，提示小鼠在本实验采用的运动强度下没有出现过量应激现象。

值得注意的是，在实验中出现运动使得健康组小鼠血清TNF-α表达量提高，IBD小鼠血清IL-1β提高的现象。在健康小鼠中，运动对抑炎因子IL-10表达量的提升作用强于TNF-α。可以推测，实验中运动引起健康小鼠血清TNF-α高表达可能是机体为了维持自身免疫平衡的适应性反应。在IBD小鼠中，运动强化了IL-1β的表达，结合小鼠DAI评分后期（4～6周）的趋势，提示在对IBD小鼠进行运动疗法时，需要更低的运动强度。